Dissection d'organes sur le poisson zèbre pour adultes

Summary

Ce protocole décrit une procédure pour identifier et disséquer les organes de l'zèbre adulte.

Abstract

Au cours des 20 dernières années, le poisson-zèbre est devenu un organisme modèle puissant pour comprendre le développement des vertébrés et de la maladie. Bien que l'analyse expérimentale de l'embryon et la larve est vaste et la morphologie a été bien documenté, les descriptions de l'anatomie de poisson zèbre pour adultes et des études sur le développement des structures pour adultes et les organes, ainsi que des techniques pour travailler avec les adultes sont absents. Les organes de la larve subissent d'importants changements dans leur structure générale, la morphologie et la localisation anatomique lors de la larve de la transition pour adultes. Extérieurement, la larve transparente développe son modèle caractéristique de pigments pour adultes rayé et jumelé nageoires pelviennes, tandis qu'à l'intérieur, les organes subissent une croissance massive et le remodelage. En outre, le primordium bipotentielles gonades se développe en testicule ou l'ovaire soit. Ce protocole identifie la plupart des organes de l'adulte et démontre des méthodes pour la dissection du cerveau, les gonades, le système gastro-intestinal, le cœur et les reins du poisson-zèbre adulte. Les organes disséqués peut être utilisé pour l'hybridation in situ, immunohistochimie, l'histologie, l'extraction d'ARN, l'analyse des protéines, et d'autres techniques moléculaires. Ce protocole aidera à l'élargissement des études dans le poisson zèbre pour inclure le remodelage des organes larvaires, la morphogenèse des organes spécifiques aux adultes et d'autres enquêtes sur les systèmes d'organes adultes.

Protocol

1. Un poisson zèbre mâle sera disséqué en premier, suivi par un poisson femelle. Avant de commencer la dissection, anesthésier un poisson dans 0,2% tricaïne puis l'euthanasier par incubation dans l'eau glacée pendant 15 minutes.
2. Commencez par une légère tapotant le poisson sec sur une serviette en papier et en le plaçant sur un tapis de dissection. Extérieurement, le poisson zèbre ont dorsale, caudale et anale et jumelé nageoires pectorales et pelviennes (figure 1).
   
   
   
   Figure 1. Poissons mâles adultes avec des ailettes étiquetés.
   
3. Pin le poisson à travers le tapis disséquer la partie charnue de la queue et la partie ventrale de la cavité de l'œil.
4. Snip la peau sur le ventre du poisson juste en avant de la nageoire anale. Coupez la peau et les muscles sous-jacents le long du ventre de la nageoire anale à l'opercule (la couverture fort au cours des branchies) (figure 2, étape 1).
   
   
   
   Figure 2. Étapes de retirer la peau et les muscles de la paroi du corps pour exposer les organes internes.
   
5. Ensuite, retirez l'opercule et la nageoire pectorale, y compris la ceinture scapulaire (l'épaisseur, de la région osseuse à la base de la nageoire) (figure 2, étape 2). Coupez la peau et les muscles sous-jacents commencent au-dessus du présent exposé arrière des branchies le long du côté du poisson et ensuite jusqu'à la nageoire anale (figure 2, étape 3).
6. Retirez soigneusement la peau et les muscles sous-jacents du côté du poisson. Beaucoup des organes internes sont maintenant visibles (figure 3).
   
   
   
   Figure 3. Adulte poissons mâles avec paroi musculaire du corps et enlevé permettant la visualisation des organes internes.
   
7. Les testicules sont longues, blanc, organes pairs qui sont attachés à la paroi dorsale du corps. Supprimer un testicule et le placer dans un plat de PBS. Examiner les testicules avec la lumière réfléchie de visualiser les tubules séminifères (Figure 4), qui contiennent des kystes aux divers stades de développement des cellules germinales à partir de spermatides spermatagonia (Leal et al., 2009).
   
   
   
   Figure 4. Dissection d'un testicule. Les structures blanches arrondie sont les tubules séminifères.
   
8. Ensuite, retirez le système gastro-intestinal de la cavité abdominale du poisson. Le foie peut être identifié par sa grande taille, la morphologie lobé, de couleur tannish, et la vascularisation importante. La vésicule biliaire, d'un vert translucide, sac rempli de liquide, et la rate, qui apparaît en rouge vif, se trouvent dans les viscères.
9. Séparée de l'intestin du reste des organes et l'étirer. L'antérieure, les régions moyenne et postérieure de l'intestin sont définis par la hauteur des plis épithéliaux (Wallace et al., 2005).
10. Placer un morceau de l'intestin dans le PBS et d'observer les replis épithéliaux en utilisant la lumière transmise.
11. Ensuite, examinez la vessie natatoire. La vessie natatoire se compose d'une chambre postérieure, qui est relié à l'œsophage par le conduit pneumatique, et une chambre antérieure, qui est relié à l'oreille interne par l'appareil de Weber (Finney et al., 2006).
12. Retirez et jetez la vessie natatoire. Détacher le poisson et re-broches c'est la face ventrale à disséquer les reins, qui est située le long de la paroi dorsale du corps. Le rein est une structure associée rose translucide avec l'aorte dorsale et les cellules pigmentées. Le rein est divisé en régions tête, le corps et la queue (figure 5). Disséquer un morceau du rein et de la placer dans du PBS. Démêler le tissu rénal de révéler les tubules rénaux.
    
    
    
    Figure 5. Localisation de la tête, le corps et la queue du rein le long de la paroi dorsale du corps.
    
13. Disséquer un poisson femelle. Comme décrit précédemment, euthanasier les poissons dans l'eau glacée et sécher avant l'épinglant sur le tapis de dissection. Enlevez la peau du côté des poissons comme précédemment démontré. L'ovaire est une structure bilobée qui est suspendu dans la cavité du corps par un mésovarium vascularisé.
14. Retirer un lobe de l'ovaire, le placer dans le PBS, et l'examiner à la lumière transmise. Les ovocytes peuvent être taquiné dehors à l'aide de fines aiguilles et ensuite mis en scène (figure 6, Selman et al., 1993). Phase I ovocytes sont environ 10 - 150 microns dans la taille et translucides. Etape II ovocytes sont environ 150 - 350 microns dans la taille et définie par l'apparition de granules corticaux. Etape III ovocytes sont de 350 à 750 microns et sont opaques à cause de l'accumulation de jaune d'oeuf. Mature étape ovocytes IV et V sont translucides et généralement ne se trouve pas dans les ovaires des femelles qui ont récemment estimé.
    
    
    
    Figure 6. Étape en direct I, II, III et des ovocytes observé sous undisséquant microscope à lumière transmise.
    
15. Ensuite, disséquer le cœur du poisson. Le cœur est situé postérieure et ventrale de la branchie. Commencez par découper le cœur et l'ensemble des tissus environnants et de la placer dans du PBS. Soigneusement disséquer loin le tissu entourant le coeur, en faisant attention à ne pas endommager l'atrium délicate.
16. Placez le coeur disséqué dans la solution de Ringer à observer les battements du cœur.
    Identifier l'atrium, ventricule et bulbe artériel (figure 7, Hu et al., 2001).
    
    
    
    Figure 7. Disséqué coeur adulte.
    
17. Remplissez la dissection en enlevant le cerveau des poissons. Commencez par désépinglage le poisson et enlever la tête avec une lame de rasoir. Retirez le tissu mou autant que possible de la face ventrale du crâne avec une pince. Retirez les yeux à l'aide des ciseaux petit ressort. Pause ouvrir le crâne et enlever l'os de la face ventrale du cerveau. Maintenant, placez la tête dans un plat de PBS et enlever les os du crâne à partir de la peau et la face dorsale du cerveau.
18. Identifier les bulbes olfactifs, télencéphale, habénula, tectum optique, le cervelet et le bulbe (figure 8, Wullimann et al, 1996;. Schilling, 2002).
    
    
    
    Figure 8. Disséqué le cerveau de poisson zèbre adulte. Vue dorsale, antérieure vers le haut.
    

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents:
0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) 200 mg tricaine powder 97.9 ml DD water ~1 ml 1 M Tris (pH 9) Adjust pH to 7.0
Phosphate buffered saline (PBS) 4.0 g NaCl 0.1 g KCl 100 ml 0.1 M PO4 Buffer, pH 7.3 150 ml dH2O
Ringer’s solution 6.7g NaCl 0.2g KCl 0.2g CaCl2 1.2g Hepes 1 L H2O Adjust pH to 7.2
Dissecting dish with mat	Electron Microscopy Sciences	70540
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91500-09