Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung und seziert Organe von den erwachsenen Zebrafisch.

Abstract

In den letzten 20 Jahren hat sich der Zebrafisch zu einem leistungsfähigen Modell-Organismus für das Verständnis der Entwicklung von Wirbeltieren und Krankheit. Obwohl experimentelle Analyse des Embryos und Larven ist sehr umfangreich und die Morphologie ist gut dokumentiert, sind die Beschreibungen der erwachsenen Zebrafisch Anatomie und Studien über die Entwicklung der erwachsenen Strukturen und Organe, zusammen mit Techniken für die Arbeit mit Erwachsenen fehlen. Die Organe der Larve eine bedeutende Veränderung in ihrer gesamten Struktur, Morphologie und anatomische Lage während des Larven zu erwachsenen Übergang. Äußerlich entwickelt die transparente Larve ihren charakteristischen Erwachsenen gestreiften Pigment Muster und gepaart Bauchflossen, während intern die Organe zu unterziehen massives Wachstum und Umbau. Darüber hinaus entwickelt die bipotentialen Geschlechtsdrüse Primordium entweder in Hoden oder Eierstock. Dieses Protokoll enthält viele Organe des Erwachsenen und zeigt Methoden für die Präparation des Gehirns, Gonaden, Magen-Darm-System, Herz und Niere des erwachsenen Zebrafisch. Die sezierten Organe können in-situ-Hybridisierung, Immunhistochemie, Histologie, RNA-Extraktion, Protein-Analyse und andere molekulare Techniken eingesetzt werden. Dieses Protokoll wird in die Erweiterung der Studien im Zebrafisch zu helfen, den Umbau des larvalen Organe, die Morphogenese von Organen spezifisch für die Erwachsenen und andere Untersuchungen der erwachsenen Organsysteme umfassen.

Protocol

1. Ein männlicher Zebrafisch wird zuerst zerlegt werden, gefolgt von einer weiblichen Fische. Vor Beginn der Dissektion, betäuben ein Fisch in 0,2% Tricaine und dann einschläfern es durch Inkubation in Eiswasser für 15 Minuten.
2. Beginnen Sie mit dem leicht klopfen die Fische trocken auf einem Papiertuch und legt es auf dem Seziertisch Matte. Äußerlich haben Zebrafisch einzigen dorsalen, Schwanz-und Afterflossen und gepaart Brust-und Bauchflossen (Abbildung 1).
   
   
   
   Abbildung 1. Erwachsene männliche Fische mit Flossen gekennzeichnet.
   
3. Pin die Fische auf die Matte Sezieren durch den fleischigen Teil des Schwanzes und der ventrale Teil der Augenhöhle.
4. Snip die Haut an den Bauch des Fisches knapp vor der Afterflosse. Schneiden Sie die Haut und darunter liegende Muskulatur entlang der Bauch von der Afterflosse, die Operculum (die harte Abdeckung über der Kiemen) (Abbildung 2, Stufe 1).
   
   
   
   Abbildung 2. Steps bei der Beseitigung von Haut und Körper Wand Muskulatur der inneren Organe freizulegen.
   
5. Dann entfernen Sie das Operculum und die Brustflosse, einschließlich der Schultergürtel (die dicken, knöchernen Region an der Basis des fin) (Abbildung 2, Schritt 2). Schneiden Sie die Haut und darunter liegende Muskulatur zu Beginn von oben der nun freiliegenden Kiemen hinten an der Seite des Fisches und dann auf der Afterflosse (Abb. 2, Schritt 3).
6. Entfernen Sie vorsichtig die Haut und darunter liegende Muskulatur von der Seite des Fisches. Viele der inneren Organe sind jetzt sichtbar (Abbildung 3).
   
   
   
   Abbildung 3. Erwachsene männliche Fische mit Körperwand und Muskulatur entfernt ermöglicht die Visualisierung der inneren Organe.
   
7. Die Hoden sind lang, weiß, gepaart Organe, die an der dorsalen Körperwand befestigt sind. Entfernen eines Hodens und legen Sie sie in eine Schüssel mit PBS. Untersuchen Sie die Hoden mit reflektiertem Licht zu den Samenkanälchen (Abbildung 4), die Zysten enthalten mit verschiedenen Stadien der Entwicklung von Keimzellen aus spermatagonia zu Spermatiden (Leal et al., 2009) zu visualisieren.
   
   
   
   Abbildung 4. Dissection eines Hodens. Die weißen rundlichen Strukturen sind die Samenleiter.
   
8. Dann entfernen Sie den Magen-Darm-System aus der Körperhöhle des Fisches. Die Leber kann durch seine Größe, gelappt Morphologie, bräunlichen Farbe und umfangreiche Vaskularisierung identifiziert werden. Die Gallenblase, eine grüne durchscheinende Flüssigkeit gefüllten Sack, und die Milz, die leuchtend rot erscheint, sind in den Eingeweiden gefunden.
9. Separate den Darm aus dem Rest der Organe und auszustrecken. Die vorderen, mittleren und hinteren Regionen des Darms werden durch die Höhe der epithelialen Falten (Wallace et al., 2005) definiert.
10. Legen Sie ein Stück des Darms in PBS und beobachten Sie die epithelialen Falten mit Durchlicht.
11. Als nächstes untersuchen die Schwimmblase. Die Schwimmblase besteht aus einer hinteren Kammer, die an der Speiseröhre über den pneumatischen Kanal, und eine vordere Kammer, die an das Innenohr durch den Weberschen Apparat (Finney et al., 2006) ist in Verbindung steht.
12. Entfernen und Entsorgen der Schwimmblase. Unpin die Fische und re-pin es Bauchseite bis zu den Nieren, die sich entlang der dorsalen Körperwand befindet sezieren. Die Niere ist ein durchsichtiges Rosa-Struktur mit der dorsalen Aorta und pigmentierten Zellen assoziiert. Die Niere ist in Kopf, Körper und Schwanz Regionen (Abbildung 5) unterteilt. Dissect ein Stück der Niere und legen Sie sie in PBS. Tease neben dem Nierengewebe der Nierentubuli zu offenbaren.
    
    
    
    Abbildung 5. Lage der Kopf, Körper und Schwanz Nieren entlang der dorsalen Körperwand.
    
13. Sezieren einen weiblichen Fisch. Wie zuvor beschrieben, euthanize die Fische in Eiswasser und pat es trocken ist, bevor Pinning es dem Sezieren Matte. Entfernen Sie die Haut von der Seite des Fisches, wie zuvor gezeigt. Der Eierstock ist ein bilobed Struktur, die in der Leibeshöhle durch einen vaskularisierten Mesovarium ausgesetzt ist.
14. Nehmen Sie einen Lappen des Eierstocks, legen Sie sie in PBS, und prüfen Sie mit Durchlicht. Die Eizellen können neben gehänselt werden mit feinen Nadeln und dann inszeniert (Abbildung 6, Selman et al., 1993). Stage I Eizellen sind ca. 10 bis 150 Mikrometer groß und durchscheinend. Stage II-Oozyten sind etwa 150 bis 350 Mikrometer groß und definiert durch das Auftreten von kortikalen Granula. Stadium III Oozyten sind 350 bis 750 Mikrometer groß und undurchsichtig sind aufgrund der Ansammlung von Dotter. Reifen Stadium IV und V Eizellen sind lichtdurchlässig und in der Regel nicht in den Eierstöcken der Frauen, die vor kurzem gepaart gefunden haben.
    
    
    
    Abbildung 6. Live Stadium I, II, III und Eizellen unter einem beobachtetenBinokular mit Durchlicht.
    
15. Als nächstes zerlegen das Herz aus dem Fisch. Das Herz befindet sich posterior und ventral der Kiemen. Beginnen Sie mit dem Herausschneiden des Herzens und all das umliegende Gewebe und es in PBS. Sorgfältig sezieren weg das Gewebe rund um das Herz, darauf achten, daß die zarte Atrium Schäden.
16. Setzen Sie den sezierten Herzen in Ringer-Lösung, um den Herzschlag zu beobachten.
    Identifizieren Sie die Atrium, Ventrikel und Bulbus arteriosus (Abb. 7, Hu et al., 2001).
    
    
    
    Abbildung 7. Dissected erwachsenen Herzens.
    
17. Füllen Sie das Sezieren, indem das Gehirn aus dem Fisch. Beginnen Sie mit der unpinning die Fische und das Entfernen der Kopf mit einer Rasierklinge. Entfernen Sie so viel Weichgewebe wie möglich von der Bauchseite des Schädels mit einer Pinzette. Entfernen Sie die Augen mit kleinen Feder Schere. Brechen Sie den Schädel und entfernen Sie die Knochen aus dem ventralen Seite des Gehirns. Setzen Sie nun den Kopf in eine Schüssel mit PBS und die Haut abziehen und Schädelknochen von der dorsalen Seite des Gehirns.
18. Identifizieren Sie die Riechkolben, Telencephalon, Habenula, Tectum opticum, Cerebellum und Medulla (Abbildung 8, Wullimann et al, 1996;. Schilling, 2002).
    
    
    
    Abbildung 8. Dissected erwachsenen Zebrafisch Gehirn. Dorsalansicht, anterior nach oben.
    

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents:
0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) 200 mg tricaine powder 97.9 ml DD water ~1 ml 1 M Tris (pH 9) Adjust pH to 7.0
Phosphate buffered saline (PBS) 4.0 g NaCl 0.1 g KCl 100 ml 0.1 M PO4 Buffer, pH 7.3 150 ml dH2O
Ringer’s solution 6.7g NaCl 0.2g KCl 0.2g CaCl2 1.2g Hepes 1 L H2O Adjust pH to 7.2
Dissecting dish with mat	Electron Microscopy Sciences	70540
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91500-09