Dissektion av organ från vuxna Zebrafish

Summary

Detta protokoll beskriver en procedur för att identifiera och dissekera organ från vuxna zebrafisk.

Abstract

Under de senaste 20 åren har zebrafisk bli en kraftfull modell organism för att förstå ryggradsdjur utveckling och sjukdom. Även experimentell analys av embryot och larven är omfattande och morfologi är väl dokumenterad, är beskrivningar av vuxna zebrafisk anatomi och studier av utvecklingen av den vuxna strukturer och organ, tillsammans med tekniker för att arbeta med vuxna saknas. Det organ larven genomgår stora förändringar i sin övergripande struktur, morfologi, och anatomiska plats under larver till vuxna övergång. Externt utvecklar den genomskinliga larven dess karakteristiska vuxen randigt pigment mönster och parade bukfenor, medan internt organ genomgår massiva tillväxt och ombyggnad. Dessutom utvecklar bipotential gonad primordium till antingen testiklar eller äggstockar. Detta protokoll anger många av de organ vuxna och visar metoder för dissekering av hjärnan, könskörtlar, gastrointestinala systemet, hjärta och njurar hos den vuxna zebrafisk. Den dissekerade organ kan användas för in situ hybridisering, immunohistokemi, histologi, RNA-extraktion, protein analys och andra molekylära tekniker. Detta protokoll kommer att bidra till en breddning av studierna i zebrafisk att omfatta ombyggnad av larver organ, morfogenes av organ som är specifika för vuxna och andra undersökningar av den vuxna organsystem.

Protocol

1. En manlig zebrafisk kommer att dissekeras först, följt av en kvinnlig fisk. Innan du börjar dissektion, söva en fisk i 0,2% Tricaine och sedan avliva den genom inkubering i isvatten i 15 minuter.
2. Börja med att försiktigt klappa fisken torr på ett papper handduk och placera den på en dissekera matta. Externt, zebrafisk har enstaka rygg, stjärt-och anal fenor och parade bröst-och bukfenor (Figur 1).
   
   
   
   Figur 1. Vuxen man fiskar med märkta fenor.
   
3. Nåla fast fisken till dissekera mattan genom den köttiga delen av svansen och den ventrala delen av ögonhålan.
4. Klipp huden på fiskens buk bara främre till analfena. Skär huden och underliggande muskler längs buken från analfenan till gällocket (det hårda som täcker över Gill) (Figur 2, steg 1).
   
   
   
   Figur 2. Stegen i att ta bort hud och kropp väggen muskler att avslöja inre organ.
   
5. Därefter tar du bort gällocket och bröstfenan, inklusive bröst gördel (den tjocka, beniga region vid foten av fin) (Figur 2, steg 2). Skär huden och underliggande muskler börjar uppifrån den nu utsätts gäl posteriort längs sidan av fisken och sedan ner till analfenan (figur 2, steg 3).
6. Ta försiktigt bort huden och underliggande muskler från sidan av fisken. Många av de inre organen är nu synlig (Figur 3).
   
   
   
   Figur 3. Vuxen man fiska med kroppen vägg och muskel bort låta visualisering av inre organ.
   
7. Testiklarna är långa, vita, parade organ som är knutna till rygg kroppen väggen. Ta bort en testikel och placera den i ett fat med PBS. Undersök testiklarna med reflekterat ljus för att visualisera sädeskanalerna (Figur 4), som innehåller cystor med olika stadier av utveckling av könsceller från spermatagonia till spermatider (Leal et al., 2009).
   
   
   
   Figur 4. Dissekering av en testikel. De vita runda strukturer sädeskanalerna.
   
8. Därefter tar du bort magtarmkanalen från kroppen hålighet av fisken. Levern kan identifieras genom sin storlek, flikiga morfologi, tannish färg och omfattande vaskularisering. Gallblåsan, en grön genomskinlig vätskefylld säck, och mjälte, som visas klarröda, finns inom inälvor.
9. Separera tarmen från resten av organen och sträcka ut det. Den främre, mitten och bakre regioner i tarmen definieras av höjden på epitelceller veck (Wallace et al., 2005).
10. Lägg en bit av tarmen i PBS och observera epiteliala vecken med hjälp av ljus.
11. Nästa undersöka simblåsa. Simblåsan består av en bakre kammare, som är ansluten till matstrupen via pneumatisk kanal, och en främre kammaren, som är ansluten till innerörat genom weberska apparaten (Finney et al., 2006).
12. Ta bort och kasta simblåsa. Unpin fisken och åter-pin den ventrala sidan uppåt för att dissekera njuren, som ligger längs ryggens kroppen väggen. Njuren är en genomskinlig rosa struktur i samband med rygg-aorta och pigmenterade celler. Njuren är uppdelad i huvud, kropp och svans regioner (Figur 5). Dissekera ut en bit av njuren och placera den i PBS. Reta isär njurvävnaden att avslöja njurtubuli.
    
    
    
    Figur 5. Placering av huvud, kropp och svans njure längs ryggens kroppen väggen.
    
13. Dissekera en kvinnlig fisk. Som tidigare beskrivits, euthanize fisken i is vatten och klappa den torr innan du sätter den till dissekera mattan. Ta bort skinnet från sidan av fisken som tidigare påvisats. Äggstocken är en bilobed struktur som är upphängd i kroppen hålighet med en vaskulariserad mesovarium.
14. Ta bort en lob i äggstockarna, placera den i PBS, och undersöka den med ljus. De oocyter kan retade varandra med hjälp av tunna nålar och sedan iscensatt (Figur 6, Selman et al., 1993). Steg I oocyter är ungefär 10 till 150 mikron och genomskinlig. Steg II oocyter är ungefär 150 till 350 mikrometer i storlek och definieras genom förekomsten av kortikal granulat. Steg III oocyter är 350 till 750 mikrometer i storlek och är ogenomskinlig på grund av ansamling av äggula. Mogen fas IV och V oocyter är genomskinliga och i allmänhet inte finns i äggstockarna hos kvinnor som nyligen har parat sig.
    
    
    
    Figur 6. Live steg I, II och III oocyter observerats under ettdissekera mikroskop med ljus.
    
15. Därefter dissekera hjärtat från fisken. Hjärtat ligger bakre och ventrala till Gill. Börja med att skära ut hjärtat och alla omgivande vävnad och placera den i PBS. Försiktigt dissekera bort den vävnad som omger hjärtat, var försiktig så du inte skadar den känsliga atrium.
16. Placera dissekerade hjärtat i Ringers lösning att observera hjärtslag.
    Identifiera förmak, kammare och bulbus arteriosus (Figur 7, Hu et al., 2001).
    
    
    
    Figur 7. Dissekerade vuxen hjärta.
    
17. Fyll i dissektion genom att ta bort hjärnan från fisken. Börja med att unpinning fisken och ta bort huvudet med ett rakblad. Ta bort så mycket mjuk vävnad som möjligt från den ventrala sidan av skallen med pincett. Ta bort ögonen med hjälp av små våren sax. Bryt öppna skallen och ta bort ben från den ventrala sidan av hjärnan. Nu placera huvudet i en skål av PBS och ta bort skinn och skalle ben från ryggsidan av hjärnan.
18. Identifiera lukt lökar, telencephalon, habenula, optisk tectum, lillhjärnan och märgen (figur 8, Wullimann et al, 1996;. Schilling, 2002).
    
    
    
    Figur 8. Dissekerade vuxna zebrafisk hjärna. Dorsal visa, främre till toppen.
    

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents:
0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) 200 mg tricaine powder 97.9 ml DD water ~1 ml 1 M Tris (pH 9) Adjust pH to 7.0
Phosphate buffered saline (PBS) 4.0 g NaCl 0.1 g KCl 100 ml 0.1 M PO4 Buffer, pH 7.3 150 ml dH2O
Ringer’s solution 6.7g NaCl 0.2g KCl 0.2g CaCl2 1.2g Hepes 1 L H2O Adjust pH to 7.2
Dissecting dish with mat	Electron Microscopy Sciences	70540
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91500-09