Yetişkin Zebra balığı Organları diseksiyonu

Summary

Bu protokol, yetişkin zebrafish organların tanımlanması ve diseksiyon için bir prosedür açıklanmıştır.

Abstract

Son 20 yıl içinde, Zebra balığı omurgalı geliştirme ve hastalık anlamak için güçlü bir model organizma haline gelmiştir. Embriyo ve larva deneysel analizi kapsamlı ve morfolojisi iyi belgelenmiş oldu rağmen, yetişkin ile çalışma teknikleri ile birlikte, yetişkin zebrafish anatomi ve yetişkin yapıları ve organları geliştirme çalışmaları açıklamaları, eksiktir. Larva organları genel yapısı, morfolojisi ve larva yetişkin geçiş sırasında anatomik konumu önemli değişikliklere uğrarlar. Içsel organları büyük bir büyüme ve yeniden yapılanma tabi iken Dışarıdan şeffaf, larva, onun karakteristik yetişkin çizgili pigment desen ve eşleştirilmiş pelvik yüzgeçler gelişir. Buna ek olarak, bipotential gonad primordium testis ya da over olarak gelişir. Bu protokol birçok yetişkin organlarının tanımlayan ve beyin, gonadlar, gastrointestinal sistem, kalp ve böbrek yetişkin zebrafish diseksiyon için yöntemler göstermektedir. Disseke organların in situ hibridizasyon, immunohistokimya, histoloji, RNA ekstraksiyonu, protein analizi, ve diğer moleküler teknikler kullanılabilir. Bu protokol, larva organların yeniden şekillenme, yetişkin yetişkin organ sistemleri ve diğer tetkikler için özel organların morfolojilerinden zebrafish çalışmaların genişletilmesi yardımcı olacaktır.

Protocol

1. Bir erkek Zebra balığı dişi balık tarafından, ilk olarak disseke olacaktır. Diseksiyonu başlamadan önce,% 0.2 Tricaine bir balık uyutmak ve sonra buzlu suda 15 dakika boyunca kuluçka euthanize.
2. Balık, kuru bir kağıt havlu üzerine hafifçe okşamaya ve bir diseksiyon mat üzerine yerleştirerek başlayın. Dıştan, zebrafish tek dorsal, kaudal ve anal yüzgeçleri ve eşleştirilmiş pektoral ve pelvik yüzgeçler (Şekil 1) var.
   
   
   
   Şekil 1 etiketli yüzgeçleri Yetişkin erkek balık.
   
3. Diseksiyon mat balık etli kısmından kuyruk ve ventral kısmı göz soket pin.
4. Anal yüzgeci sadece ön balığın karnından cilt Snip. Anal yüzgeci operculum'un göbek boyunca deri ve alttaki kas (solungaç üzerinden sabit kapsayan) (Şekil 2, adım 1) kesin.
   
   
   
   Şekil 2 cilt ve vücut duvarı kas kaldırarak iç organlarda ortaya çıkarmak için adımlar.
   
5. Daha sonra, göğüs kuşak (yüzgeci tabanı kalın, kemikli bölge) (Şekil 2, adım 2) dahil olmak üzere, operculum'un ve göğüs yüzgeci çıkarın. Anal fin (Şekil 2, 3. adım) daha sonra balık yan boyunca kesin ve şimdi maruz solungaç posteriora üzerindeki deri ve alttaki kas başında.
6. Balık yan cilt ve cilt altındaki kas dikkatlice çıkarın. Iç organların çoğu artık görünür (Şekil 3).
   
   
   
   Şekil 3 Yetişkin erkek balık, vücut duvarı ve kas ile iç organların görüntülenmesi izin kaldırıldı .
   
7. Testisler dorsal vücut duvara bağlı uzun, beyaz, eşleştirilmiş organları. Testis çıkarın ve PBS bir tabak koyun. Spermatagonia gelen spermatid gelişmekte olan germ hücreleri çeşitli aşamalarında (Leal ve ark, 2009) ile kist içeren seminifer tübüller (Şekil 4), görselleştirmek için yansıyan ışık ile testis inceleyin.
   
   
   
   Şekil 4 testis diseksiyonu. Beyaz yuvarlak yapılar seminifer tübüller.
   
8. Sonra, gastrointestinal sistem, balığın vücut boşluğuna çıkarın. Karaciğer büyük boyutu, loblu morfolojisi, tannish renk ve geniş vaskülarizasyon tarafından tespit edilebilir. Iç organları parlak kırmızı görünen safra kesesi, yeşil saydam bir sıvı dolu kese ve dalak, içinde bulundu.
9. Organların geri kalanından ayrı ve bağırsak dışarı uzatmak. Bağırsak, orta, ön ve arka bölgelerde epitel kıvrımlarının yüksekliği (Wallace ve ark, 2005) tarafından tanımlanmıştır.
10. PBS içinde bağırsağın bir parçası yerleştirin ve iletilen ışık kullanarak epitel kıvrımları gözlemlemek.
11. Ardından, yüzme kesesi inceleyin. Pnömatik kanalı ve Weberci cihazları (Finney ve ark, 2006) yoluyla iç kulağa bağlı bir ön kamara ile yemek borusuna bağlı bir arka odası, yüzme kesesi oluşur.
12. Kesesi çıkarın ve atın. Balık Çıkar'ı ve yeniden-pin ventral taraf dorsal vücut duvarı boyunca yer alan böbrek, incelemek. Böbrek dorsal aorta ve pigmentli hücreleri ile ilişkili bir saydam pembe bir yapıdır. Böbrek, baş, gövde, ve kuyruk bölgeleri (Şekil 5) bölünmüştür. Böbrek bir parça inceleyin ve PBS yerleştirin. Renal tübüller ortaya çıkarmak için, böbrek dokusu ayrı Tease.
    
    
    
    Şekil 5, baş, gövde, ve kuyruk dorsal vücut duvarı boyunca böbrek yeri .
    
13. Bir kadın bir balık teşrih. Daha önce açıklandığı gibi, buzlu suda balık euthanize ve diseksiyon mat bağlantılarını önce kuru pat. Daha önce de gösterildiği gibi balık yan deri çıkarın. Yumurtalık vaskülarize mesovarium vücut boşluğunda asılı bir loblu bir yapıdır.
14. Yumurtalık biri lob çıkarın, PBS yerleştirin ve iletilen ışık incelemek. Oosit ince iğneler kullanılarak dışında alay ve sonra (Şekil 6, Selman ve ark, 1993) sahnelenen olabilir. Evre I oosit yaklaşık 10 - 150 mikron boyutu ve saydam. Boyutu 350 mikron ve kortikal granül görünümü tarafından tanımlanan - Evre II oosit yaklaşık 150. Evre III oosit 350 - 750 mikron boyutunda ve sarısı birikimi nedeniyle opak. Olgun Evre IV ve V oosit saydam ve genellikle son zamanlarda evlendirilen kadın yumurtalıklarda bulundu.
    
    
    
    Şekil 6 Canlı sahne I, II ve III oosit altında gözleniriletilen ışık mikroskobu diseksiyon.
    
15. Sonra, balık kalp teşrih. Kalp ve solungaç ventral posterior yer almaktadır. Kalp ve çevresindeki doku kesme ve PBS içinde yerleştirerek başlayın. Dikkatli bir şekilde hassas atrium zarar vermemek için dikkatli olmak, kalbi saran doku uzak teşrih.
16. Disseke kalp kalp atışı gözlemlemek için Ringer solüsyonu içine yerleştirin.
    Atriyum, ventrikül ve bulbus arteriosus (Şekil 7, Hu ve ark, 2001) belirleyin.
    
    
    
    Şekil 7 erişkin kalp Dissected.
    
17. Balık beyin kaldırarak diseksiyonu tamamlayın. Balık unpinning ve bir jilet ile baş kaldırarak başlayın. Forseps ile kafatası ventral taraftan, mümkün olduğu kadar yumuşak doku çıkarın. Gözleri küçük yaylı makas kullanılarak çıkarın. Kafatası açık Break ve beynin ventral tarafında kemik kaldırmak. Şimdi PBS bir tabak içinde kafa ve beyin dorsal tarafında deri ve kafatası kemikleri çıkarın.
18. Koku ampuller belirlenmesi, telencephalon, habenula, optik tectum, serebellum ve medulla (Schilling, Şekil 8, 2002 Wullimann ve ark, 1996).
    
    
    
    Şekil 8 Dissected yetişkin zebrafish beyin. Üst dorsal anterior görünümü.
    

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents:
0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) 200 mg tricaine powder 97.9 ml DD water ~1 ml 1 M Tris (pH 9) Adjust pH to 7.0
Phosphate buffered saline (PBS) 4.0 g NaCl 0.1 g KCl 100 ml 0.1 M PO4 Buffer, pH 7.3 150 ml dH2O
Ringer’s solution 6.7g NaCl 0.2g KCl 0.2g CaCl2 1.2g Hepes 1 L H2O Adjust pH to 7.2
Dissecting dish with mat	Electron Microscopy Sciences	70540
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91500-09