Summary
इस प्रोटोकॉल की पहचान और विदारक वयस्क zebrafish से अंगों के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है.
Abstract
पिछले 20 वर्षों में, zebrafish हड्डीवाला विकास और रोग को समझने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव बन गया है. हालांकि भ्रूण और लार्वा के प्रयोगात्मक विश्लेषण के व्यापक है और आकारिकी अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है, वयस्क zebrafish शारीरिक रचना और वयस्क संरचनाओं और अंगों के विकास के अध्ययन के विवरण, वयस्कों के साथ काम करने के लिए तकनीकों के साथ मिलकर की कमी कर रहे हैं. लार्वा के अंगों को उनके समग्र संरचना, आकृति विज्ञान, और वयस्क संक्रमण के लिए लार्वा के दौरान संरचनात्मक स्थान में महत्वपूर्ण परिवर्तन से गुजरना. बाह्य, पारदर्शी लार्वा इसकी विशेषता वयस्क धारीदार वर्णक पैटर्न और बनती पैल्विक पंख विकसित है, जबकि आंतरिक अंगों को बड़े पैमाने पर विकास और remodeling गुजरना. इसके अलावा, bipotential जननपिंड primordium या तो वृषण या अंडाशय में विकसित करता है. इस प्रोटोकॉल वयस्क के अंगों के कई दिखाता है और मस्तिष्क, gonads, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल प्रणाली, हृदय, और वयस्क zebrafish के गुर्दे के विच्छेदन के लिए तरीकों को दर्शाता है है. dissected अंगों स्वस्थानी संकरण में immunohistochemistry, ऊतक विज्ञान, शाही सेना निकासी, प्रोटीन विश्लेषण, और अन्य आणविक तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल zebrafish में अध्ययन के व्यापक बनाने में सहायता के लार्वा अंगों की remodeling, वयस्क और अन्य वयस्क अंग प्रणालियों की जांच के लिए विशिष्ट अंगों के morphogenesis शामिल होगा.
Protocol
- एक पुरुष zebrafish dissected पहली बार हो जाएगा, एक महिला मछली द्वारा पीछा किया. विच्छेदन शुरू करने से पहले, 0.2% Tricaine में एक मछली anesthetize और फिर 15 मिनट के लिए बर्फ के पानी में ऊष्मायन द्वारा यह euthanize.
- हल्के से एक कागज तौलिया पर सूखी मछली ठोक और यह एक विदारक चटाई पर रखने द्वारा शुरू करो. बाह्य, zebrafish एकल पृष्ठीय, दुम और गुदा पंख और बनती छाती पर का कवच और श्रोणि पंख (चित्रा 1) है.
चित्रा 1 लेबल पंख के साथ वयस्क पुरुष मछली. - पूंछ के मांसल भाग के माध्यम से विदारक चटाई मछली और थैली के उदर भाग पिन.
- बस गुदा फिन के लिए पूर्वकाल मछली के पेट पर त्वचा धज्जी. काटें त्वचा और पेट के साथ अंतर्निहित मांसपेशियों गुदा फिन से operculum (गिल अधिक कठिन को कवर) (चित्रा 2, चरण 1).
चित्रा 2 त्वचा और शरीर दीवार मांसपेशियों को हटाने के लिए आंतरिक अंगों को बेनकाब करने में कदम. - अगले, छाती पर का कवच की करधनी (मोटी फिन के आधार पर बोनी क्षेत्र) (चित्रा 2, चरण 2) सहित operculum और छाती पर का कवच पंख, निकालना. मछली के पक्ष के साथ त्वचा और अंतर्निहित मांसपेशियों की शुरुआत से अब उजागर गिल पीछे से ऊपर कट और फिर नीचे गुदा फिन (चित्रा 2, चरण 3).
- ध्यान से त्वचा को हटाने और मछली की ओर से अंतर्निहित मांसपेशियों. आंतरिक अंगों में से कई अब दिखाई दे रहे हैं (चित्रा 3).
चित्रा 3 शरीर दीवार और मांसपेशियों के साथ वयस्क पुरुष मछली आंतरिक अंगों के दृश्य की अनुमति हटा दिया. - testes लंबे, सफेद, बनती अंगों कि पृष्ठीय शरीर की दीवार से जुड़े होते हैं कर रहे हैं. वृषण निकालें और पीबीएस के एक डिश में जगह. परिलक्षित प्रकाश के साथ वृषण जांच बीजदार tubules (चित्रा 4), जो विकासशील spermatagonia से spermatids जर्म कोशिकाओं के विभिन्न चरणों (Leal एट अल., 2009) के साथ अल्सर होते हैं कल्पना.
चित्रा 4 एक वृषण के विच्छेदन. सफेद गोलाकार संरचना बीजदार tubules हैं. - अगला, मछली के शरीर गुहा से गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल प्रणाली को हटा दें. जिगर अपने बड़े आकार, lobed आकारिकी, tannish रंग, और व्यापक vascularization से पहचाना जा सकता है. पित्ताशय की थैली, एक हरे रंग की पारदर्शी थैली तरल पदार्थ से भरे, और तिल्ली, जो लाल उज्ज्वल दिखाई देता है आंत के भीतर पाए जाते हैं.
- अलग अंगों के आराम से आंत और इसे बाहर खिंचाव. आंत की पूर्वकाल, मध्य, और कूल्हों क्षेत्रों उपकला परतों की ऊंचाई (वालेस एट अल., 2005) द्वारा परिभाषित कर रहे हैं.
- पीबीएस में आंत का एक टुकड़ा प्लेस और संचारित प्रकाश का उपयोग उपकला परतों निरीक्षण.
- अगले, तैरना मूत्राशय की जांच. तैरना मूत्राशय पीछे कक्ष, जो वायवीय वाहिनी, और एक पूर्वकाल कक्ष, जो Weberian तंत्र (Finney एट अल., 2006) के माध्यम से भीतरी कान करने के लिए जुड़ा हुआ है के माध्यम से घुटकी से जुड़ा है के होते हैं.
- तैरना मूत्राशय निकालें और त्यागने. मछली को खोलना और फिर से पिन यह ventral पक्ष को गुर्दे की है, जो पृष्ठीय शरीर की दीवार के साथ स्थित है टुकड़े करना. गुर्दे एक पारदर्शी गुलाबी संरचना पृष्ठीय महाधमनी और pigmented कोशिकाओं के साथ जुड़े है. गुर्दे के सिर, शरीर और पूंछ (चित्रा 5) क्षेत्रों में विभाजित है. गुर्दे का एक टुकड़ा काटना और यह पीबीएस में जगह. छेड़ो अलावा गुर्दे ऊतक गुर्दे tubules प्रकट.
चित्रा 5 सिर, शरीर, और पृष्ठीय शरीर दीवार के साथ पूंछ गुर्दे के स्थान. - एक महिला मछली काटना. जैसा कि पहले बताया, बर्फ के पानी में मछली euthanize और यह पहले यह विदारक चटाई के लिए लगाए पॅट सूखी. मछली के रूप में पहले प्रदर्शन की ओर से त्वचा निकालें. अंडाशय एक bilobed संरचना है कि शरीर की गुहा में एक vascularized mesovarium द्वारा निलंबित कर दिया है.
- अंडाशय की एक पालि निकालें, यह पीबीएस में जगह है, और इसे संचारित प्रकाश के साथ जांच. oocytes छेड़ा जा सकता है के अलावा ठीक सुइयों का उपयोग करते हुए और फिर मंचन (चित्रा 6, Selman एट अल. +१,९९३). मैं स्टेज oocytes लगभग 10 - आकार और पारदर्शी में 150 microns. स्टेज द्वितीय oocytes 150 के बारे में हैं - आकार में 350 microns और cortical granules की उपस्थिति द्वारा परिभाषित. चरण III oocytes 350 - आकार में 750 microns और अपारदर्शी की जर्दी के संचय के कारण हैं. परिपक्व चरण चतुर्थ और वी oocytes पारदर्शी हैं और mated है कि हाल ही में महिलाओं के अंडाशय में आम तौर पर नहीं मिला.
चित्रा 6 लाइव चरण मैं, द्वितीय और तृतीय oocytes के तहत मनायाप्रेषित प्रकाश के साथ खुर्दबीन विदारक. - अगले, मछली से दिल टुकड़े करना. दिल पीछे और गिल के लिए उदर स्थित है. दिल और आसपास के ऊतकों के सभी बाहर काटने और यह पीबीएस में रखकर द्वारा शुरू करो. ध्यान से दूर दिल आसपास के ऊतक काटना, नाजुक आलिंद नुकसान नहीं सावधान किया जा रहा है.
- घंटी के लिए दिल की धड़कन का निरीक्षण समाधान में dissected दिल प्लेस.
Atrium, निलय, और बल्बस arteriosus (7 चित्रा, हू एट अल., 2001) को पहचानें.
7 चित्रा वयस्क दिल dissected. - विच्छेदन मछली से मस्तिष्क को हटाने के द्वारा पूरा करें. मछली unpinning और एक धार के साथ सिर को हटाने के द्वारा शुरू करो. संदंश के साथ खोपड़ी के उदर की ओर से ज्यादा नरम ऊतक के रूप में संभव के रूप में निकालें. छोटे वसंत कैंची का उपयोग आँखों निकालें. खोपड़ी को खोलने के तोड़ और मस्तिष्क के उदर ओर से हड्डी निकाल. अब पीबीएस के एक डिश में सिर जगह है और मस्तिष्क के पृष्ठीय तरफ से त्वचा और खोपड़ी हड्डियों को हटाने.
- घ्राण बल्ब को पहचानें, telencephalon, habenula, ऑप्टिक tectum, सेरिबैलम और मज्जा (8 चित्रा, Wullimann एट अल, 1996, शिलिंग, 2002).
8 चित्रा वयस्क zebrafish मस्तिष्क dissected. पृष्ठीय देखने के लिए, शीर्ष पर पूर्वकाल.
Disclosures
जानवरों पर प्रयोगों विश्वविद्यालय पेंसिल्वेनिया संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
इस काम के द्वारा NIH अनुदान R01 HD050901 एमसीएम और अमेरिकन कैंसर सोसायटी टीजी Postdoctoral फैलोशिप पीएफ - # 05-041-01-DDC समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| 0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) 200 mg tricaine powder 97.9 ml DD water ~1 ml 1 M Tris (pH 9) Adjust pH to 7.0 |
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| Phosphate buffered saline (PBS) 4.0 g NaCl 0.1 g KCl 100 ml 0.1 M PO4 Buffer, pH 7.3 150 ml dH2O |
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| Ringer’s solution 6.7g NaCl 0.2g KCl 0.2g CaCl2 1.2g Hepes 1 L H2O Adjust pH to 7.2 |
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| Dissecting dish with mat | Electron Microscopy Sciences | 70540 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
References
- Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio). J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).
- Hu, N., Yost, H. J., Clark, E. B. Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish. Anat Rec. 264, 1-12 (2001).
- Leal, M. C., Cardoso, E. R., Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., França, L. R., Schulz, R. W. Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations. Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).
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- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech Dev. 122, 157-173 (2005).
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