Dissezione di organi dal Zebrafish adulti

Summary

Questo protocollo descrive una procedura per l'individuazione e organi da sezionare il pesce zebra adulto.

Abstract

Negli ultimi 20 anni, il pesce zebra è diventato un organismo modello potente per la comprensione dello sviluppo dei vertebrati e le malattie. Anche se l'analisi sperimentale degli embrioni e larve è ampia e la morfologia è stato ben documentato, descrizioni di anatomia zebrafish adulti e studi di sviluppo delle strutture per adulti e degli organi, insieme alle tecniche per lavorare con gli adulti sono carenti. Gli organi della larva subire importanti cambiamenti nella loro struttura complessiva, la morfologia e la posizione anatomica durante le larve di transizione per adulti. Esternamente, la larva trasparente sviluppa il suo modello caratteristico pigmento strisce adulti e coppie pinne pelviche, mentre internamente, gli organi subiscono un'enorme crescita e rimodellamento. Inoltre, il primordio bipotential gonade si sviluppa in entrambi i testicoli o ovaie. Questo protocollo identifica molti degli organi degli adulti e vengono utilizzati dei metodi per la dissezione del cervello, gonadi, apparato gastrointestinale, cuore, reni e del pesce zebra adulto. Gli organi sezionati può essere utilizzato per l'ibridazione in situ, tecniche di immunoistochimica, istologia, estrazione di RNA, analisi delle proteine, e altri molecolare. Questo protocollo aiuterà a l'ampliamento di studi nel zebrafish per includere la ristrutturazione degli organi larvali, la morfogenesi degli organi specifici per le indagini adulti e altri sistemi di organi adulti.

Protocol

1. Un pesce zebra maschio sarà sezionato per primo, seguito da un pesce femmina. Prima di iniziare la dissezione, anestetizzare un pesce nello 0,2% Tricaine e poi l'eutanasia dalla incubazione in acqua ghiacciata per 15 minuti.
2. Iniziare con una leggera accarezzando il pesce secco su un tovagliolo di carta e posizionarlo su una stuoia dissezione. Esternamente, pesce zebra hanno un'unica dorsale, pinna caudale e anale e associato pinne pettorali e pelviche (Figura 1).
   
   
   
   Figura 1. Adulto pesci di sesso maschile con le pinne etichettati.
   
3. Pin il pesce al tappeto dissezione attraverso la parte carnosa della coda e la parte ventrale della cavità oculare.
4. Tagliare la pelle del ventre del pesce appena anteriormente alla pinna anale. Tagliare la pelle e il muscolo sottostante lungo il ventre dalla pinna anale per l'opercolo (il rivestimento duro sopra la branchia) (Figura 2, punto 1).
   
   
   
   Figura 2. Passi nella rimozione della pelle e la parete muscolare del corpo per esporre gli organi interni.
   
5. Quindi, rimuovere l'opercolo e la pinna pettorale, tra cui la cintura pettorale (la spessa, regione ossea alla base della pinna) (Figura 2, punto 2). Tagliare la pelle e l'inizio del muscolo sottostante dall'alto del ora esposti branchie posteriormente lungo il lato del pesce e poi giù per la pinna anale (Figura 2, punto 3).
6. Rimuovere con cura la pelle e muscolo sottostante dal lato del pesce. Molti degli organi interni sono ora visibili (Figura 3).
   
   
   
   Figura 3. Pesci adulti di sesso maschile con la parete del corpo e dei muscoli rimossi permettendo la visualizzazione degli organi interni.
   
7. I testicoli sono lunghe, bianche, organi accoppiati che sono attaccate alla parete dorsale del corpo. Rimuovere un testicolo e mettetelo in un piatto di PBS. Esaminare il testicolo di luce riflessa di visualizzare i tubuli seminiferi (Figura 4), che contengono le cisti con varie fasi di sviluppo di cellule germinali da spermatagonia a spermatidi (Leal et al., 2009).
   
   
   
   Figura 4. Dissezione di un testicolo. Le strutture bianche tondeggianti sono i tubuli seminiferi.
   
8. Quindi, rimuovere il sistema gastrointestinale dalla cavità del corpo del pesce. Il fegato può essere identificato per le grandi dimensioni, morfologia lobi, colore tannish, e la vascolarizzazione estesa. La colecisti, un verde traslucido sacco pieno di liquido, e la milza, che appare rosso vivo, si trovano all'interno del viscere.
9. Separare l'intestino dal resto degli organi e tratto fuori. L'anteriore, le regioni a metà, e posteriore dell'intestino sono definiti da l'altezza delle pieghe epiteliali (Wallace et al., 2005).
10. Posizionare un pezzo di intestino in PBS e osservare le pieghe epiteliali a luce trasmessa.
11. Successivamente, esaminare la vescica natatoria. La vescica natatoria è costituito da una camera posteriore, che è collegato all'esofago attraverso il dotto pneumatico, e una camera anteriore, che è collegata all'orecchio interno attraverso l'apparato weberiano (Finney et al., 2006).
12. Rimuovere e gettare la vescica natatoria. Sblocca il pesce e ri-pin che lato ventrale fino a sezionare il rene, che si trova lungo la parete del corpo dorsale. Il rene è una struttura trasparente rosa, associata con l'aorta dorsale e cellule pigmentate. Il rene è suddiviso in regioni della testa, corpo e coda (Figura 5). Sezionare un pezzo del rene e metterlo in PBS. Prendere in giro a parte il tessuto renale per rivelare i tubuli renali.
    
    
    
    Figura 5. Posizione testa, corpo, e rene coda lungo la parete dorsale del corpo.
    
13. Sezionare un pesce femmina. Come descritto in precedenza, l'eutanasia il pesce in acqua ghiacciata e pat asciugare prima di pinning al tappeto dissezione. Togliere la pelle dal lato del pesce come precedentemente dimostrato. L'ovaio è una struttura bilobata che è sospeso nella cavità del corpo da un mesovarium vascolarizzato.
14. Rimuovere un lobo delle ovaie, è posto in PBS, ed esaminarlo con luce trasmessa. Gli ovociti possono essere presi in giro a parte utilizzando aghi sottili e poi messo in scena (Figura 6, Selman et al., 1993). Stadio I ovociti sono circa 10 - 150 micron di dimensione e traslucido. Ovociti fase II sono circa 150 - 350 micron nel formato e definito dalla comparsa di granuli corticali. Ovociti stadio III sono 350-750 micron e sono opachi a causa dell'accumulo di tuorlo. Ovociti maturi stadio IV e V sono trasparenti e generalmente non si trovano nelle ovaie delle femmine che hanno recentemente accoppiato.
    
    
    
    Figura 6. Palco dal vivo I, II, III e ovociti osservati sotto undissezione microscopio a luce trasmessa.
    
15. Successivamente, sezionare il cuore dal pesce. Il cuore si trova posteriore e ventrale alla branchia. Iniziate tagliando fuori il cuore e tutto il tessuto circostante e mettendolo in PBS. Con attenzione sezionare via il tessuto che circonda il cuore, facendo attenzione a non danneggiare l'atrio delicato.
16. Mettere il cuore sezionato in soluzione di Ringer per osservare il battito cardiaco.
    Identificare l'atrio, ventricolo e bulbo arterioso (Figura 7, Hu et al., 2001).
    
    
    
    Figura 7. Dissected cuore adulto.
    
17. Completa la dissezione rimuovendo il cervello dal pesce. Inizia unpinning il pesce e la rimozione della testa con una lama di rasoio. Rimuovere il più possibile i tessuti molli dal lato ventrale del cranio con una pinza. Rimuovere gli occhi con le forbici piccola sorgente. Rompere il cranio e togliere l'osso dalla parte ventrale del cervello. Ora posto la testa in un piatto di PBS e togliere la pelle e le ossa del cranio dal lato dorsale del cervello.
18. Identificare i bulbi olfattivi, telencefalo, habenula, tetto ottico, cervelletto e midollo (Figura 8, Wullimann et al, 1996;. Schilling, 2002).
    
    
    
    Figura 8. Dissected zebrafish cervello adulto. Vista dorsale, anteriore verso l'alto.
    

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents:
0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) 200 mg tricaine powder 97.9 ml DD water ~1 ml 1 M Tris (pH 9) Adjust pH to 7.0
Phosphate buffered saline (PBS) 4.0 g NaCl 0.1 g KCl 100 ml 0.1 M PO4 Buffer, pH 7.3 150 ml dH2O
Ringer’s solution 6.7g NaCl 0.2g KCl 0.2g CaCl2 1.2g Hepes 1 L H2O Adjust pH to 7.2
Dissecting dish with mat	Electron Microscopy Sciences	70540
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91500-09