דג הזברה פסיפס Transgenesis להערכת רצפים Enhancer

Summary

אנו מדגימים את הגישה שלנו למציאת פוטנציאל משפר אלמנטים מן הגנים מוסדר מבחינה התפתחותית והערכה תפקידם דרך transgenesis דג הזברה פסיפס.

Abstract

השלמת רצף הגנום האנושי, יחד עם זה של מינים רבים אחרים, הדגיש את האתגר של ייחוס תפקיד ספציפי רצפים שאינם קידוד. פונקציה אחת הבולטות שביצעה השבר ללא קידוד של הגנום הוא לווסת את שעתוק הגנים, אולם אין שיטות יעילות רחב לחזות cis-הרגולציה אלמנטים רצף הדנ"א העיקרי. פיתחנו פרוטוקול יעילה מבחינה תפקודית להעריך את הפוטנציאל cis-הרגולציה אלמנטים דרך transgenesis דג הזברה. הגישה שלנו מציעה יתרונות משמעותיים על פני תרבית תאים טכניקות המבוססות על הגנים החשובים מבחינה התפתחותית, שכן הוא מספק מידע על ויסות הגנים במרחב ובזמן. לעומת זאת, הוא מהיר יותר ופחות יקר מאשר ניסויים דומים העכברים הטרנסגניים, ואנחנו שגרתי להחיל אותה על רצפים מבודדים מן הגנום האנושי. כאן אנו מדגימים את הגישה שלנו בחירת האלמנטים לבדיקה המבוססת על שימור רצף פרוטוקול שלנו רצפים שיבוט microinjecting אותם עוברי דג הזברה.

Protocol

1. בחירה שיבוט של רצפים שימור לבדיקה

1. צריך קודם כל לזהות רצפים רגולטוריים פוטנציאל בדיקה פונקציונלית. אנו מסתמכים על שימור רצף אבולוציוני כקריטריון לבחור רצפים, ולרוב השימוש PhastCons אלגוריתם, אשר נגיש כמו מסלול בדפדפן הגנום UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). עם זאת, קיימים אלגוריתמים רבים אחרים הזמינים כדי להעריך שימור מינים על פני רצף.
2. ברגע שיש לנו נבחרת רצפים שלנו, אנו מתכננים primers כדי להגביר את כל הרצף של הדנ"א הגנומי. Primers יש לבחור כדי להגביר את האזור נשמרת פלוס 30 או יותר זוגות בסיסים בכל צד.
3. עבור הגברה של רצפים נבחר אנו משתמשים במערכת LA TAKARA TaqTM. Polymerases אחרים יעבדו, אך חשוב להשתמש תערובת הכוללת אנזים עם יכולת הגהה, כדי למזער את הסיכוי של טעויות הציג במהלך הגברה. אנו לוודא את גודל amplicon ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose.
4. אנו משתמשים 8/GW/TOPO PCR ת"א שיבוט Kit (Invitrogen) לשכפל את המוצר PCR לתוך וקטור המכיל כניסה לאתרים רקומבינציה attL, כדי ליצור את שיבוט כניסה Gateway. התגובה השיבוט יעיל יותר עם מוצר ה-PCR טריים, ולכן עדיף לבצע את השיבוט תוך יום של PCR. טרנספורמציה של זנים DH5α מתבצעת ואחריו מבחר התנגדות spectinomycin.
5. אנו לאמת תוצר של שיבוט ת"א על ​​ידי עיכול של ~ 500ng של פלסמיד עם EcoRI לשחרר את הכנס, ולאשר את גודל להכניס את ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose. המלצנו רצף לאמת את רצף להוסיף אוריינטציה; primers המשמש הגברה עשוי לשמש גם עבור סידור.
6. מאת clone את הערך, רצף ללא קידוד משומר הוא דילג על ידי רקומבינציה LR כדי Gateway וקטור היעד שלנו מוכן, pGW_cfosGFP1, באמצעות Gateway LR Clonase II אנזים מערבבים (Invitrogen). טרנספורמציה של זנים DH5α מתבצעת ואחריו מבחר התנגדות אמפיצילין.
7. אנו לאמת תוצר של רקומבינציה LR על ידי עיכול של ~ 500ng של פלסמיד עם EcoRV לשחרר את הכנס, ולאשר את גודל להכניס את ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose. לאחר שיבוט מדויק זוהה, אנו מכינים פלסמיד דנ"א באמצעות HiSpeed ​​Qiagen ® ערכת Midi פלסמיד. בנוסף, אנו מטהרים את הפלסמיד באמצעות ערכת ה-PCR QIAquick טיהור, על פי הפרוטוקולים של היצרן, ה-DNA elute עם 30 מים μL חינם RNase. הפלסמיד הוא מדולל לריכוז של 125 ng / μL ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לפני זריקות.
8. קידוד RNA פונקציונלי אנזים Tol2 transposase הוא עיבד במבחנה מן pDB600 plasmid2. אנו לטהר את הפלסמיד באמצעות ערכת Midi-Prep Qiagen, אז linearize 10-20 מיקרוגרם עם XbaI. סינתזת mRNA מתבצעת בעקבות mMACHINE mMESSAGE ערכת פרוטוקול (Ambion).
9. אנו לטהר לזרז את הרנ"א בהתאם להוראות ערכה. אנו resuspend RNA לריכוז סופי של ~ 1μg/μl, או 20 μl לתגובה אחת, במים RNase בחינם, לכמת ידי לספקטרופוטומטריה UV. אנחנו גם לנתח ~ 1μg של RNA על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose לאמת שעתוק באורך מלא. למרות טה סטנדרטי או TBE ג'ל הוא מתאים ניתוח זה, למאגר מדגם denaturing הכלול בערכה שעתוק יש להשתמש בהתאם להוראות הערכה.
10. אנחנו בודקים כל אצווה חדשה של transposase RNA ליעילות ידי ביצוע זריקות עם (איור 1) ידוע פלסמיד. לאחר האימות, RNA מחולק aliquots קטנים המאוחסנים ב -80 ° C, כדי למנוע הפשרת חוזרות refreezing aliquots של הפרט.
    
    באיור 1. העובר דג הזברה הוזרקו Sox10 עכבר משפר כביקורת. (למעלה) תמונה brightfield (התחתון) תמונה GFP פלואורסצנטי. כל אצווה חדשה של transposase RNA הוא נבדק על יעילות.

2. Microinjection של עוברי דג הזברה לניתוח פסיפס מהונדס

1. אנחנו מסירים את המחטים עבור microinjection מ 1.2 מ"מ זכוכית נימה OD נימי על פולר P-97 סאטר micropipette, עם תוכנית שנועדה תשואה טיפ חזק עם להתחדד חדה למדי לחדור chorions ללא פגע. אנו לשבור את עצות ביד תחת stereomicroscope כדי בקוטר חיצוני של כ 15 מיקרומטר, באמצעות סכין גילוח נקי שקופיות מיקרומטר. המחטים יכול להתבצע יום לפני זריקות, ומאוחסנים צלחת מחזיק מכוסה כדי לשמור על ניקיון.
2. אנו שומרים על דג הזברה שלנו על מחזור קבוע חשוך אור, עם 14 שעות של אור, תחת conditions3 סטנדרטי. יום לפני ביצוע microinjections, הקמנו דגים הזדווגויות מתוזמן במיכלי גידול קטן, כל אחד בהיקף של טנק בבסיס, להכניס מחוררת, ומכסה פלסטיק. אנחנו שמים שלוש נקבות או שני זכרים לכל tank בשורות מקבילות.
3. בבוקרו של microinjections, זמן קצר לאחר מחזור אור מתחילה, אנחנו מתחילים שילוב זכרים ונקבות מים מערכת שטופלו נקי לייצור ביצים. חשוב לבדוק את הדגים לעיתים קרובות, לאסוף את הביצים בתוך כמה דקות של הנחת, כדי לקבל קבוצות מסונכרן היטב. ייצור ביצה יכול להישמר במשך שעתיים עד שלוש שעות, על ידי המשך לשלב קבוצות של דגים טריים בכל בוקר.
4. עם משעמם רחב, 5 "1 / 4 כוס פיפטה פסטר מצוידת בנורה לטקס, אנו למיין את העוברים שנאספו לתוך 60 x 15 מ"מ צלחות פטרי, מילאו חלקית עם העובר Medium2, בקבוצות של 50 עוברים, ולסמן את הזמן שנאספו על את המכסה של כל מנה.
5. לאחר שהדגים החלו בהנחת, אנו מכינים פתרון הזרקת טרי ידי ערבוב הבא צינור microfuge על הקרח:

   רכיב
   Transposon מניות פלסמיד (125ng/μl)	1μl
   Transposase RNA מניות (175ng/μl)	1μl
   מניות פנול אדום (2% ב H 2 O)	0.5μl
   RNase מים חינם	2.5μl

   
   המחטים הזרקת מוטלות מחזיק כלים מילא pipetting 500 nl טיפות של תמיסת הזרקה אל הקצה רחב של מחט כל אחד. לאחר נוזלי נשאבים אל קצה דרך פעולה נימי, פתרון נוסף ניתן להוסיף סך של μl 1.5-2. אנחנו מכינים לפחות שתי מחטים לפתרון כל זריקה.
6. המחט מלא הוא נטען לתוך היד החזיקה מחט בעל פניאומטיים Pico-משאבת ההזרקה או לחץ דומה, מוגדר ומחובר טנק N2 לפי הוראות היצרן. אנו לכייל כרכים הזרקה על ידי מדידת קוטר של טיפות גורשו לתוך שמן מינרלי בשקופית מיקרומטר. בדרך כלל, זמן הזרקה של 120 ms עם לחץ של 20 psi תניב טיפה של כ 1 nl, אבל שינויים קלים בקוטר מחט ישפיע אלה פרמטרים recalibration ייתכן שתידרש בין מחטים.
7. הזריקות מבוצעות תחת stereomicroscope בהגדלה 6-10X. אנו משתמשים זוג מלקחיים בסדר להחזיק את העובר במקום, לדחוף את המזרק עם לחץ קבוע דרך סיסית לתוך החלמון של העובר על תא אחד או בשלב מוקדם two התא. באופן אידיאלי, אנחנו עמדת קצה מחט החלמון ממש מתחת בלסטומרים. כ 1 nl של פתרון הזרקת מסולק והמחט נסוגה. עבור כל אחד לבנות אנו מזריקים ≥ 200 עוברים. כמו כן, חשוב מאוד עבור כל אחד מצמד של עוברים נאסף, כדי להציל את צלחת של עוברים בקרת uninjected.
8. לאחר זריקות הושלמו אנו למיין את העוברים על ידי הסרת ביצים מופרית, עוברים פגומים, וזריקות נכשל (עוברים עם אדום לא פנול ב בלסטומרים). לאחר מכן, אנו עוברים דגירה במדיום העובר על 28.5 מעלות צלזיוס עד השעה המתאימה לתצפיות.

3. ניתוח דפוסי ביטוי פסיפס

1. לאחר זמן דגירה המתאים, אנו בוחנים את העוברים מוזרק עבור פלואורסצנטי. העיתוי תלוי דפוס הביטוי של הגן הנורמלי דג הזברה אנדוגני, אבל אנחנו נראים בדרך כלל יומי באמצעות הפריה הימים הראשונים שלאחר 5.
2. אנו בודקים את העוברים על הקרינה על macroscope אולימפוס MVX10 המותאם epifluorescence, אבל כל מיקרוסקופ דומה מסוגל הדמיה צריכת חשמל נמוכה יעבוד. אם יש מספר גדול של עוברים שמתו או פיתחו באופן חריג ביום הראשון, מסתכל על שולטת uninjected עבור המצמד כי כדי לראות אם הם נראים נורמליים. אם שולט להיראות נורמלי, הבעיה הנפוצה ביותר היא טוהר מספקת של ה-DNA מוזרק. כמו כן, עוברים בשלבים מוקדמים רגישים הסכום הכולל של פלסמיד מוזרק, ולכן יתכן כי כימות היה מדויק ו-DNA יותר מדי שהוזרק.
3. כאשר בוחנים את העוברים, יש לזכור כי הם יהיו כולם בשביל לבנות את פסיפס מוזרק. יהיה צורך לבדוק היטב את כל העוברים, במיוחד אם תחום הצפוי של ביטוי הוא קטן. זכור גם כי הביטוי יכול להיות דינמי, הקרינה חזקה ביום 1 עלול להיעלם על ידי 2 יום, עוברים שלילי הביטוי הראשון 3 ימים יכול להראות משהו ביום 4.
4. אנחנו בוחרים כמה עוברי עם ביטוי נרחב יותר, ולהשתמש אלה כדי לתעד את דפוס הקרינה על ידי photomicroscopy. לאחר 5 ימים של תצפיות, העוברים יש להחזיר את המתקן וגדל כמו מניה. בתוך כמה חודשים, המבוגרים יכול להיות מוקרן להעברת germline של transgenes.

4. תוצאות

אנו רואים v רחבariety של דפוסי ורמות הביטוי, בהתאם לאלמנט משפר להיות מנותח. אנחנו בדרך כלל מעוניינים מאוד דפוסי רקמות ספציפיות ביטוי, ולעתים קרובות הם מתמקדים הגנים מתבטאת השלד. ולעתים קרובות הם מתמקדים הגנים מתבטאת השלד. תרשים 2 מציג דוגמאות של דפוסי ביטוי פסיפס צפינו בעוברים מוזרק שלנו, עם משפרי ויסות ביטוי סחוס ועצם. לבסוף, חלק ניכר של רצפי שנבדקו לא לווסת ביטוי ברקמה מסוימת. עבור אלו, אנו רואים לעתים קרובות ביותר פלואורסצנציה מעט מאוד, אולי מפוזרים כמה תאים לכל עובר. לעתים רחוקות יותר, נוכל לראות את הקרינה, אבל רק שני אתרים משותפים עבור הביטוי חוץ רחמי, האפידרמיס ואת שרירי השלד (איור 3).

איור 2. דוגמה של דפוסי סחוס ועצם הביטוי שנצפתה עוברים מוזרק.

איור 3. יש מתאם קטן בין המיקום היחסי של משפר את הגן ורגולציה הביטוי. חלק משמעותי של רצפי שנבדקו לא לווסת ביטוי ברקמה מסוימת. אלה לעתים קרובות יש מעט מאוד פלואורסצנטי, או אולי שני אתרים משותפים עבור ביטוי אקטופי: האפידרמיס שרירי השלד. (למעלה) brightfield (התחתון) תמונה GFP הקרינה התמונה.

Discussion

אנחנו הוכיחו את הגישה בשימוש במעבדה שלנו לניתוח יעיל של משפרי פוטנציאליים באמצעות transgenesis דג הזברה. לרוב, אנו משתמשים בגישה זו כדי לחפש רקמות ספציפיות משפרי הקשורים הגנים האנושיים. למרות חוסר הומולוגיה רצף ברור רוב הזמן בין אדם ודגים ללא קידוד רצפים, אנו מוצאים כי גישה זו היא בדרך כלל מצליחה לזהות משפרי עבור הגנים שמעניינים אותנו. גורמים קריטיים להצלחה מטפלים בהכנה של ה-DNA ואת הפלסמיד RNA transposase, והזרקת ובחינת מספר מספיק של עוברי לבנות עבור כל אחד. שיטות הכללי של הבנייה transgene, microinjections העובר, וביטוי ניתוח פסיפס יהיה החלים על יצירת קווי דג הזברה מהונדס למטרות רבות אחרות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Takara LA Taq	Takara Bio Inc	RR02M
pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit	Invitrogen	K2500-20
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen	11791-100
Library efficiency competent cells DH5α	Invitrogen	12535-019
Library efficiency competent cells DB3.1	Invitrogen	11782-018
mMESSAGE mMACHINE Kit	Ambion	AM1340
HiSpeed Plasmid Midi Kit	Qiagen	12643
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820