Summary
Vi visar vårt sätt att hitta potentiella enhancer element från utvecklingsmässigt gener och utvärdera deras funktion genom mosaik zebrafisk genmodifiering.
Abstract
Slutförandet av människans arvsmassa, tillsammans med många andra arter, har visat på utmaningen att tillskriva särskilda funktion för icke kodande sekvenser. En framträdande funktion utföras av den icke kodande delen av genomet är att reglera gentranskription, men det finns inga effektiva metoder för att i stort sett förutsäga cis-reglerande element från primär DNA-sekvens. Vi har utvecklat ett effektivt protokoll till funktionellt utvärdera potentiella cis-reglerande element genom zebrafisk genmodifiering. Vårt tillvägagångssätt har betydande fördelar framför cell-kultur baserad teknik för utvecklingsstörda viktiga gener, eftersom det ger information om tid och genreglering. Omvänt är det snabbare och billigare än liknande experiment i transgena möss, och vi rutinmässigt tillämpa den på sekvenser isolerad från det mänskliga genomet. Här kan vi visa vårt tillvägagångssätt för att välja element för testning baserad på sekvens bevarande och våra protokoll för kloning av sekvenser och microinjecting dem i zebrafisk embryon.
Protocol
1. Urval och kloning av bevarade sekvenser för testning
- Man måste först identifiera potentiella reglerande sekvenser för funktionella tester. Vi förlitar oss på evolutionära sekvensen bevarande som ett kriterium för att välja sekvenser, och oftast använder algoritmen PhastCons, som är tillgänglig som ett spår på UCSC Genome webbläsaren (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Men det finns många andra algoritmer som finns för att utvärdera sekvens bevarandet över arter.
- När vi har valt våra sekvenser, design vi primers för att förstärka varje sekvens från arvsmassans DNA. Primers bör väljas för att förstärka bevarad regionen plus 30 eller fler par bas på vardera sidan.
- För förstärkning av den valda sekvenser vi använder Takara LA TaqTM system. Andra polymeraser kommer att fungera, men det är viktigt att använda en blandning som innehåller ett enzym med korrekturläsning förmåga, för att minimera risken för fel introduceras under förstärkning. Vi kontrollerar amplicon storlek med agarosgelelektrofores.
- Vi använder PCR 8/GW/TOPO TA Kloning Kit (Invitrogen) att klona PCR-produkten i en post vektor som innehåller attL rekombination webbplatser, för att generera klona Gateway posten. Kloning reaktionen är effektivare med färska PCR-produkten, så det är bäst att utföra kloning inom en dag av PCR. Omvandling i DH5α stammar utförs följs av spektinomycin motstånd urval.
- Vi kontrollerar produkten av TA kloning genom rötning av ~ 500ng av plasmid med EcoRI att släppa in, och bekräfta storleken på insatsen med agarosgelelektrofores. Vi rekommenderar sekvensering för att verifiera insatsen sekvens och orientering, primers för amplifiering kan också användas för sekvensering.
- Från posten klon, är den icke-kodande bevarad sekvens skytteltrafik av LR rekombination till vår Gateway klar destination vektor, pGW_cfosGFP1, med hjälp av Gateway LR Clonase II enzym Mix (Invitrogen). Omvandling i DH5α stammar utförs följs av ampicillin motstånd urval.
- Vi kontrollerar produkten av LR rekombination genom rötning av ~ 500ng av plasmid med EcoRV att släppa in, och bekräfta storleken på insatsen med agarosgelelektrofores. När en exakt klon har identifierats, förbereder vi plasmid-DNA med Qiagen HiSpeed ® Plasmid Midi Kit. Vi renar vidare plasmiden med QIAquick PCR Purification Kit, enligt tillverkarens protokoll, och eluera DNA med 30 mikroliter RNas fritt vatten. Den plasmid är utspädd till en koncentration av 125 ng / mikroliter och förvaras vid 4 ° C före injektioner.
- RNA kodning funktionella Tol2 transposase enzym transkriberas in vitro från pDB600 plasmid2. Vi renar plasmiden med Qiagen Midi-Prep kit, då linjärisera 10-20 mikrog med XbaI. MRNA-syntesen sker efter mMESSAGE mMACHINE Kit Protocol (Ambion).
- Vi renar och fällningen RNA enligt kit instruktioner. Vi resuspendera RNA till en slutlig koncentration av ~ 1μg/μl, eller 20 l för en enda reaktion, i RNas fritt vatten, och kvantifiera av UV-spektrofotometri. Vi analyserar också ~ 1μg av RNA med agarosgelelektrofores att verifiera full längd transkription. Även om en standard TAE eller TBE gel är lämplig för denna analys bör denaturering provet bufferten medföljer transkription kit användas enligt kit instruktioner.
- Vi testar varje nytt parti transposase RNA för effekt genom att utföra injektioner med en känd plasmid (Figur 1). Efter kontroll är RNA delas upp i små alikvoter och lagras vid -80 ° C, för att undvika upprepade upptining och omfrysning enskilda alikvoter.
Figur 1. Zebrafisk embryo injiceras med musen Sox10 förstärkare som en kontroll. (Top) brightfield bild (längst ned) GFP fluorescens bild. Varje ny sats av transposase RNA testas för effekt.
2. Mikroinjektion av zebrafisk embryon för mosaik transgena analys
- Vi drar nålar för mikroinjektion från 1,2 mm YD glödtråden kapillär glas på en Sutter P-97 Mikropipett Avdragare, med ett program som syftar till att ge en stark spets med en ganska skarp taper att penetrera intakt chorions. Vi bryta tips med handen under ett stereomikroskop med en yttre diameter på cirka 15 ìm, med en ren rakblad och en mikrometer bild. Nålarna kan göras dagen innan injektionerna, och förvaras i en täckt hålla skålen att hålla ren.
- Vi bibehåller vår zebrafisk på en vanlig ljus mörker-cykel med 14 timmars ljus, enligt standard conditions3. Dagen innan du utför microinjections satte vi upp fisk för tidsinställda parningar i liten uppfödning tankar, vardera bestående av en bas tank, en slitsad infoga och ett plastlock. Vi ställer tre honor eller två hanar per tonANK i parallella rader.
- På morgonen den microinjections, kort efter ljuset cykeln börjar, börjar vi att kombinera män och kvinnor i rent system-behandlat vatten för äggproduktion. Det är viktigt att kolla på fisk ofta, och samla ägg inom några minuter om, för att få väl synkroniserad partier. Äggproduktion kan bibehållas under två till tre timmar, genom att fortsätta att kombinera färsk grupper av fiskbestånd i hela morgonen.
- Med ett brett hål, 5 1 / 4 "glas pasteurpipett försedd med en latex glödlampa, vi sorterar in embryon i 60 x 15 mm petriskålar, delvis fyllda med Embryo Medium2, i grupper om 50 embryon, och markera den tid som samlas in på locket på varje rätt.
- När fisken har börjat om, förbereder vi färska injektionslösning genom att blanda följande i en mikrofugrör på is:
Komponent Transposon plasmid lager (125ng/μl) 1μl Transposase RNA lager (175ng/μl) 1μl Fenolrött lager (2% H 2 O) 0.5μl RNas fritt vatten 2.5μl
Den kanyler läggs i att hålla rätter och fylls genom att pipettera 500 nl droppar av injektionslösning på den breda änden av varje nål. Efter att vätskan dras till toppen genom kapillärkraften kan ytterligare lösning läggas till totalt 1,5-2 l. Vi förbereder minst två nålar för varje injektion lösning. - Den fyllda nål laddas i handhållna nålen innehavaren av en pneumatisk Pico-Pump eller liknande påtryckningar injektorn, konfigurerad och ansluten till en N2 tank enligt tillverkarens anvisningar. Vi kalibrerar injektionsvolymer genom att mäta diametern av droppar utvisade i mineralolja på en mikrometer bild. Vanligtvis kommer en injektion tid på 120 ms med ett tryck på 20 psi ge en droppe på ca 1 NL, men små variationer i nål diameter kommer att påverka dessa parametrar och omkalibrering kan krävas mellan nålar.
- Injektionerna utförs under ett stereomikroskop vid 6-10x förstoring. Vi använder ett par fina pincett för att hålla embryot på plats, tryck in injektionsnålen med stadigt tryck genom chorion och in i gulan av ett embryo i en cell eller tidigt två cell skede. Helst position vi kanylspetsen i äggulan strax under blastomerer. Cirka 1 NL för injektion lösning är utvisade och nålen dras tillbaka. För varje konstruerar vi tillföra ≥ 200 embryon. Det är också mycket viktig, för varje koppling insamlade embryon, för att rädda ett fat uninjected kontroll embryon.
- Efter injektioner är klar sorterar vi de embryon genom att ta bort obefruktade ägg, skadade embryon, och misslyckats injektioner (embryon utan fenol rött i blastomerer). Vi inkubera sedan embryon i embryot medium vid 28,5 ° C tills en lämplig tidpunkt för observationer.
3. Analys av mönster mosaik uttryck
- Efter en lämplig inkubationstid undersöker vi injiceras embryon för fluorescens. Tidpunkten beror på det normala uttryck mönster av den endogena zebrafisk genen, men vi brukar titta dagligen genom de första 5 dagar efter befruktningen.
- Vi undersöker embryon för fluorescens på en Olympus MVX10 makroskop anpassade för epifluorescence, men något liknande mikroskop som kan strömsnål imaging kommer att fungera. Om det finns ett stort antal embryon som dött eller utvecklat onormalt under den första dagen, titta på uninjected kontroller för att kopplingen för att se om de ser normala. Om kontrollerna ser normala, är det vanligaste problemet otillräcklig renhet av tillförd arvsmassa. Även embryon i tidiga skeden är känsliga för den totala mängden injiceras plasmid, så det är möjligt att kvantifiera var felaktiga och alltför mycket DNA injiceras.
- Vid prövningen av embryon, kom ihåg att de alla kommer att bli mosaik för injicerade konstruktion. Det kommer att bli nödvändigt att titta noga på alla embryon, särskilt om den förväntade domänen uttryck är liten. Kom också ihåg att uttrycket skulle kunna vara dynamisk, stark fluorescens dag 1 kan försvinna genom att dag 2, och embryon som negativt för uttryck i 3 dagar och skulle kunna visa något på dag 4.
- Vi väljer några embryon med mer omfattande uttryck, och använda dessa för att dokumentera mönster av fluorescens av photomicroscopy. Efter 5 dagars observationer bör embryon tillbaka till anläggningen och upp som ett lager. I flera månader kan de vuxna screenas för könsceller överföring av transgener.
4. Resultat
Vi ser ett stort variety av mönster och nivåer av uttryck, beroende på förstärkare elementet som analyseras. Vi är oftast intresserade av mycket vävnad särskilt uttryck mönster, och ofta fokuserar på gener som uttrycks i skelettet. och är ofta fokus på gener som uttrycks i skelettet. Figur 2 visar exempel på mönster mosaik uttryck vi sett i våra injiceras embryon, med medel som reglerar uttryck i brosk och ben. Slutligen, reglera en väsentlig del av testade sekvenser inte vävnaden specifika uttryck. För dessa har vi oftast ser mycket lite fluorescens, kanske några spridda celler per embryo. Mindre ofta kan vi se fluorescens, men bara i två vanliga platser för ektopisk uttryck, epidermis och skelettmuskulaturen (Figur 3). 
Figur 2. Exempel på brosk och ben uttryck mönster som observerats i injiceras embryon. 
Figur 3. Det finns något starkt samband mellan platsen för enhancer förhållande till genen och reglering av yttrandefriheten. En betydande del av de testade sekvenser som inte reglerar vävnad specifika uttryck. Dessa har ofta väldigt lite fluorescens, eller kan ha två vanliga platser för ektopisk uttryck: epidermis och skelettmuskulaturen. (Top) brightfield bild (längst ned) GFP fluorescens bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har visat den metod som används i vårt laboratorium för effektiv analys av potentiella förstärkare med zebrafisk genmodifiering. Oftast använder vi denna metod för att leta efter vävnadsspecifika medel i samband med mänskliga gener. Trots bristen på självklara sekvenshomologi delen av tiden mellan människa och fisk icke-kodande sekvenser, finner vi att detta tillvägagångssätt är oftast framgångsrik i att identifiera medel för gener av intresse för oss. De kritiska faktorerna för framgång är att ta hand vid beredningen av plasmid-DNA och transposase RNA och injicera och granska ett tillräckligt antal embryon för varje konstruktion. Den allmänna metoder för transgen konstruktion, microinjections embryo och mosaik uttryck analys skulle gälla att skapa transgena zebrafisk linjer för många andra ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Paula Roy för utmärkt fisk djurhållning, och Steve Ekker för slags gåva pDB600 plasmiden. Dessa studier har finansierats genom ett bidrag till SF från NHGRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | |
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | |
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | |
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- The Zebrafish Book. Westerfield, M. , 3 ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (1995).
