La transgénèse Zebrafish Mosaic pour évaluer des séquences Enhancer
Summary
Nous démontrons notre approche pour trouver des éléments potentiels de gènes enhancer régulés par le développement et l'évaluation de leur fonction par transgenèse poisson zèbre mosaïque.
Abstract
L'achèvement du séquençage du génome humain, ainsi que de nombreuses autres espèces, a souligné le défi d'attribuer une fonction spécifique à séquences non codantes. Une fonction importante réalisée par la fraction non codante du génome est de réguler la transcription des gènes, mais il n'existe pas de méthodes efficaces pour prédire les gros éléments cis-régulateurs de la séquence d'ADN primaire. Nous avons développé un protocole efficace pour évaluer le potentiel fonctionnel éléments cis-régulateurs par transgenèse poisson zèbre. Notre approche offre des avantages significatifs sur culture cellulaire des techniques basées sur les gènes de développement importante, car elle fournit des informations sur la régulation des gènes spatiale et temporelle. Inversement, il est plus rapide et moins coûteux que des expériences similaires chez les souris transgéniques, et nous avons l'habitude de l'appliquer à des séquences isolées à partir du génome humain. Ici nous démontrons notre approche de sélection des éléments pour le test basé sur la conservation de séquence et de notre protocole de clonage de séquences et les micro-injection dans des embryons de poisson zèbre.
Protocol
Discussion
Nous avons démontré l'approche utilisée dans notre laboratoire pour l'analyse efficace des exhausteurs potentiels en utilisant la transgénèse poisson zèbre. Le plus souvent, nous utilisons cette approche pour chercher tissu-spécifique exhausteurs associées à des gènes humains. Malgré le manque d'homologie de séquence évidente la plupart du temps entre les humains et les poissons des séquences non codantes, nous constatons que cette approche est généralement réussi à identifier pour les exha…
Acknowledgements
Nous remercions Mme Paula Roy pour l'élevage de poissons excellents, et Steve Ekker pour le don de type du plasmide pDB600. Ces études ont été financées par une subvention de la SF à partir du NHGRI.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | ||
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | ||
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | ||
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | ||
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | ||
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | ||
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (1995).
