Summary
Dimostriamo il nostro approccio alla ricerca di potenziali elementi enhancer regolati da geni evolutivamente e valutando la loro funzione attraverso transgenesi mosaico zebrafish.
Abstract
Il completamento della sequenza del genoma umano, insieme a quello di molte altre specie, ha evidenziato la sfida di attribuire funzione specifica di non sequenze codificanti. Una funzione importante svolta dalla parte non codificante del genoma è di regolare trascrizione del gene, tuttavia, non esistono metodi efficaci per prevedere in generale cis-normativo elementi di sequenza del DNA primario. Abbiamo sviluppato un protocollo efficiente per la valutazione funzionale potenziale cis-normativo elementi attraverso transgenesi zebrafish. Il nostro approccio offre vantaggi significativi rispetto alle tecniche di coltura cellulare a base di geni evolutivamente importante, poiché fornisce informazioni sulla regolazione genica spaziale e temporale. Al contrario, è più veloce e meno costoso di esperimenti simili in topi transgenici, e noi di routine si applica alle sequenze isolate dal genoma umano. Qui mostriamo il nostro approccio alla selezione di elementi per il test basato sulla conservazione di sequenza e il nostro protocollo per le sequenze di clonazione e microinjecting li in embrioni di zebrafish.
Protocol
1. Selezione e clonazione di sequenze conservate per i test
- Si deve prima identificare i potenziali sequenze regolatrici per i test funzionali. Facciamo affidamento sulla conservazione sequenza evolutiva come criterio per selezionare le sequenze, e più spesso usare il PhastCons algoritmo, che è accessibile come una traccia sul browser UCSC Genome (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Tuttavia, ci sono molti altri algoritmi disponibili per valutare conservazione sequenza tra le specie.
- Una volta che abbiamo selezionato i nostri sequenze, progettiamo primers per amplificare ogni sequenza di DNA genomico. Primers dovrebbero essere selezionati per amplificare la regione conservata più 30 o più coppie di basi su entrambi i lati.
- Per l'amplificazione delle sequenze selezionate usiamo il Takara LA sistema TaqTM. Altre polimerasi funzionerà, ma è importante utilizzare un mix che include un enzima con capacità di correzione di bozze, per ridurre al minimo le possibilità di errori introdotti durante l'amplificazione. Noi verificare la dimensione amplicone con elettroforesi su gel di agarosio.
- Usiamo il pCR 8/GW/TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) per clonare il prodotto di PCR in un vettore di ingresso contenente siti ricombinazione attL, per generare il clone voce di gateway. La reazione clonazione è più efficiente con fresco prodotto di PCR, per cui si consiglia di eseguire la clonazione in un giorno della PCR. Trasformazione in ceppi DH5α viene eseguita seguita dalla selezione resistenza spectinomicina.
- Verifichiamo il prodotto della clonazione TA digestione dei ~ 500ng di plasmide con EcoRI per liberare l'inserto, e confermare la dimensione dell'inserto tramite elettroforesi su gel di agarosio. Si consiglia di sequenziamento per verificare la sequenza di inserimento e di orientamento; primer utilizzati per l'amplificazione può essere utilizzato anche per il sequenziamento.
- Dal clone di ingresso, la non-codificante sequenza è conservata la spola dalla ricombinazione LR al nostro vettore di destinazione Gateway pronto, pGW_cfosGFP1, utilizzando Gateway LR Clonase II enzima Mix (Invitrogen). Trasformazione in ceppi DH5α viene eseguita seguita dalla selezione resistenza all'ampicillina.
- Verifichiamo il prodotto della ricombinazione LR digestione dei ~ 500ng di plasmide con EcoRV per liberare l'inserto, e confermare la dimensione dell'inserto tramite elettroforesi su gel di agarosio. Una volta che un clone preciso è stato identificato, ci prepariamo DNA plasmidico utilizzando il HiSpeed Qiagen ® plasmidi Kit Midi. Abbiamo ulteriormente purificare il plasmide usando la Purificazione QIAquick PCR Kit, secondo protocolli produttore, ed eluire il DNA con 30 microlitri di acqua RNasi libero. Il plasmide è diluito ad una concentrazione di 125 ng / mL e conservato a 4 ° C prima di iniezioni.
- RNA codifica funzionale Tol2 enzima trasposasi è trascritto in vitro dal pDB600 plasmid2. Noi purificare il plasmide con il Midi-Prep kit Qiagen, poi linearizzare 10-20 mg con XbaI. La sintesi di mRNA viene effettuata seguendo il protocollo mMACHINE mMessage Kit (Ambion).
- Noi purificare e precipitare l'RNA secondo le istruzioni del kit. Noi risospendere l'RNA ad una concentrazione finale di circa 1μg/μl, o 20 l per una singola reazione, in acqua RNasi libero, e quantificare mediante spettrofotometria UV. Abbiamo anche analizzare ~ 1μg di RNA mediante elettroforesi su gel di agarosio per verificare la trascrizione completa lunghezza. Anche se un TAE standard o TBE gel sia sufficiente a tale analisi, il buffer campione denaturazione incluso con il kit di trascrizione devono essere utilizzati secondo le istruzioni del kit.
- Ci prova ogni nuovo lotto di trasposasi RNA per l'efficacia eseguendo iniezioni con un noto plasmide (Figura 1). Dopo la verifica, l'RNA è divisa in piccole aliquote e conservati a -80 ° C, per evitare di scongelare e ricongelare ripetuti aliquote individuali.
Figura 1. Embrione zebrafish iniettato il topo SOX10 enhancer come controllo. (Top) immagine Brightfield (basso) GFP immagine fluorescenza. Ogni nuovo lotto di trasposasi RNA è testato per l'efficacia.
2. Microiniezione di embrioni di zebrafish per l'analisi del mosaico transgenici
- Tiriamo gli aghi per microiniezione di vetro da 1,2 mm di diametro filamento capillare su un P-97 Sutter Estrattore Micropipetta, con un programma progettato per produrre una punta forte con un cono abbastanza forte da penetrare chorions intatto. Rompiamo le punte a mano allo stereomicroscopio di un diametro esterno di circa 15 micron, con una lama di rasoio pulito e uno scivolo micrometro. Gli aghi può essere fatta il giorno prima di iniezioni, e conservati in un piatto tenendo coperto da pulire.
- Manteniamo il nostro pesce zebra su un normale ciclo di luce scura, con 14 ore di luce, secondo lo standard conditions3. Il giorno prima microiniezioni spettacolo, abbiamo costituito di pesce per accoppiamenti a tempo in serbatoi di piccolo allevamento, ognuno composto da un serbatoio di base, un inserto scanalato, e un coperchio di plastica. Abbiamo posto tre femmine e due maschi per ogni tank in file parallele.
- La mattina del microiniezioni, poco dopo il ciclo di luce comincia, cominciamo combinando maschi e femmine nella pulizia del sistema-acqua trattata per la produzione di uova. E 'importante controllare frequentemente il pesce, e raccogliere le uova in pochi minuti di posa, per ottenere lotti ben sincronizzati. Produzione di uova può essere mantenuta per due o tre ore, continuando a combinare gruppi di pesce fresco per tutta la mattina.
- Con un largo foro, 5 1 / 4 "pipetta Pasteur in vetro dotata di un bulbo in lattice, ordiniamo gli embrioni raccolti in 60 x 15 mm Petri, parzialmente riempito con Embryo Medium2, in gruppi di 50 embrioni, e segnare il tempo di raccolti il coperchio di ogni piatto.
- Una volta che i pesci hanno cominciato posa, ci prepariamo soluzione fresca iniezione mescolando quanto segue in una provetta per microcentrifuga sul ghiaccio:
Componente Trasposone magazzino plasmide (125ng/μl) 1ml Trasposasi RNA stock (175ng/μl) 1ml Rosso fenolo magazzino (2% in H 2 O) 0.5μl RNasi libero dell'acqua 2.5μl
Gli aghi di iniezione sono previste nel tenere piatti e riempito pipettando nl 500 gocce di soluzione di iniezione sull'estremità gamma di ogni ago. Dopo che il liquido viene aspirato alla punta attraverso l'azione capillare, la soluzione è possibile aggiungere a un totale di 1,5-2 microlitri. Prepariamo almeno due aghi per ogni soluzione iniezione. - L'ago riempito viene caricato nella mano ago titolare di un pneumatico Pico-pompa o simili pressione iniettore, configurato e collegato ad un serbatoio N2 secondo le istruzioni del produttore. Noi calibrare volumi di iniezione misurando il diametro delle goccioline espulse in olio minerale su un vetrino micrometrico. Tipicamente, un tempo di iniezione di 120 ms con una pressione di 20 psi produrrà una goccia di circa 1 nl, ma lievi variazioni nella ago diametro influenzerà questi parametri e di ricalibrazione può essere richiesto tra aghi.
- Le iniezioni vengono effettuate sotto uno stereomicroscopio a 6-10X di ingrandimento. Noi usiamo una pinza sottile per tenere l'embrione in posizione, inserire l'ago di iniezione con una pressione costante attraverso il corion e nel tuorlo di un embrione alla cellula iniziale di una o due stadi cellulari. Idealmente, si posizione la punta dell'ago nel tuorlo appena sotto i blastomeri. Circa 1 nl di soluzione iniettabile viene espulso e l'ago ritirata. Per ciascun costrutto iniettiamo ≥ 200 embrioni. E 'anche molto importante, per ogni frizione degli embrioni raccolti, per salvare un piatto di embrioni controllo uninjected.
- Dopo le iniezioni sono stati completati ci ordinare i embrioni eliminando uova non fecondate, embrioni danneggiati, e le iniezioni fallito (embrioni senza rosso fenolo in blastomeri). Abbiamo poi incubare gli embrioni nel medio embrione a 28,5 ° C fino al momento opportuno per le osservazioni.
3. Analisi dei pattern di espressione mosaico
- A seguito di un tempo di incubazione del caso, esaminiamo gli embrioni iniettati per fluorescenza. La tempistica dipende dal modello normale espressione del gene endogeno zebrafish, ma siamo soliti guardare ogni giorno attraverso i primi 5 giorni dopo la fecondazione.
- Si esaminano gli embrioni per la fluorescenza su un macroscopio Olympus MVX10 misura per epifluorescenza, ma qualsiasi microscopio capace di simili immagini a bassa potenza funzionerà. Se ci sono un gran numero di embrioni che sono morti o sviluppati in modo anomalo il primo giorno, un'occhiata ai controlli uninjected per quella della frizione per vedere se hanno un aspetto normale. Se i controlli appaiono normali, il problema più comune è la purezza insufficiente del DNA iniettato. Inoltre, gli embrioni nelle prime fasi sono sensibili alla quantità totale di plasmide iniettato, quindi è possibile che la quantificazione era impreciso e troppo DNA è stato iniettato.
- Nell'esaminare gli embrioni, di tenere presente che essi saranno tutti mosaico per il costrutto iniettato. Sarà necessario guardare con attenzione tutti gli embrioni, specialmente se il dominio atteso di espressione è di piccole dimensioni. Ricorda inoltre che l'espressione potrebbe essere dinamico; fluorescenza forte il giorno 1 potrebbe scomparire entro il giorno 2, e gli embrioni negativa per l'espressione i primi 3 giorni potrebbe mostrare qualcosa il giorno 4.
- Abbiamo scelto alcuni embrioni con l'espressione più ampia, e utilizzare questi per documentare il modello di fluorescenza da photomicroscopy. Dopo 5 giorni di osservazioni, gli embrioni devono essere restituiti alla struttura e cresciuto come un magazzino. In alcuni mesi, gli adulti possono essere sottoposti a screening per la trasmissione germinale dei transgeni.
4. Risultati
Vediamo un ampio variety di modelli e livelli di espressione, a seconda dell'elemento enhancer oggetto di analisi. Di solito siamo molto interessati ad pattern di espressione dei tessuti specifici, e sono spesso concentrandosi su geni espressi nello scheletro. e sono spesso concentrandosi su geni espressi nello scheletro. La Figura 2 mostra esempi di pattern di espressione del mosaico che abbiamo osservato nei nostri embrioni iniettati, con esaltatori di regolazione dell'espressione di cartilagine e ossa. Infine, una parte notevole di sequenze testate non regolano l'espressione specifica del tessuto. Per queste, che più spesso di vedere fluorescenza molto poco, forse poche cellule sparse per embrione. Meno spesso, potremmo vedere la fluorescenza, ma solo in due luoghi comuni di espressione ectopica, l'epidermide e il muscolo scheletrico (Figura 3). 
Figura 2. Esempio di pattern di espressione della cartilagine e dell'osso osservato in embrioni iniettati. 
Figura 3. Non c'è scarsa correlazione tra la posizione del relativo enhancer alla regolazione dei geni e di espressione. Una parte consistente di sequenze testate non regolare l'espressione specifica del tessuto. Questi hanno spesso fluorescenza molto poco, o possono avere due siti comune per l'espressione ectopica: l'epidermide e il muscolo scheletrico. (Top) Brightfield immagine (in basso) GFP immagine fluorescenza.
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Discussion
Abbiamo dimostrato l'approccio utilizzato nel nostro laboratorio per l'analisi efficiente di esaltatori di potenziale utilizzo transgenesi zebrafish. Molto spesso, noi usiamo questo metodo per cercare tessuto-specifici associati con esaltatori di geni umani. Nonostante la mancanza di omologia di sequenza evidente maggior parte del tempo tra uomo e pesce sequenze non codificanti, troviamo che questo approccio è di solito efficace nell'identificare esaltatori per i geni di interesse per noi. I fattori critici di successo sono la cura nella preparazione del DNA plasmidico e l'RNA trasposasi, e l'iniezione e l'esame di un numero sufficiente di embrioni per ogni costrutto. I metodi generali di costruzione transgene, microiniezioni embrione, e analisi di espressione mosaico sarebbe applicabile a generare linee di zebrafish transgenico per molti altri scopi.
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Acknowledgments
Ringraziamo la signora Paula Roy per l'allevamento di pesce, e Steve Ekker per il gentile dono del pDB600 plasmide. Questi studi sono stati finanziati da una sovvenzione di SF da NHGRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | |
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | |
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | |
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- The Zebrafish Book. Westerfield, M. , 3 ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (1995).
