Summary
我々は、分化段階の遺伝子から潜在的なエンハンサー要素を発見し、モザイクのゼブラフィッシュのトランスジェネシスを通じてその機能を評価するために我々のアプローチを示しています。
Abstract
ヒトゲノム配列の完成は、他の多くの種のそれとともに、非コード配列に特定の機能をascribingの課題を浮き彫りにしました。ゲノムの非コード化割合で実施つの著名な機能は、遺伝子の転写を調節することですが、広く主要なDNA配列からのシス調節エレメントを予測する有効な方法はありません。我々は機能的にはゼブラフィッシュの遺伝子導入を通じて、潜在的なシス調節エレメントを評価するための効率的なプロトコルを開発した。それは空間的、時間的な遺伝子調節に関する情報を提供するため、我々のアプローチは、発達の重要な遺伝子の細胞培養ベースの技術上の重要な利点があります。逆に、それはより速く、より安価なトランスジェニックマウスで同様の実験よりも、我々は日常的に人間のゲノムから単離されたシーケンスに適用します。ここでは、クローニングシーケンスのシーケンスの保全と我々のプロトコルに基づいており、ゼブラフィッシュ胚にそれらをマイクロインジェクションをテストするための要素を選択するために我々のアプローチを示しています。
Protocol
1。選択してテストするための保存された配列のクローニング
- 一つは、最初の機能テストのための潜在的な調節配列を識別する必要があります。我々は、配列を選択する基準として進化的な配列保存性に依存し、最も頻繁にUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）上のトラックとしてアクセス可能なアルゴリズムのPhastConsを、使用してください。しかし、種を越えて配列保存性を評価するために利用できる他の多くのアルゴリズムがあります。
- かつて我々のシーケンスを選択している、我々は、ゲノムDNAからそれぞれの配列を増幅するプライマーを設計する。プライマーは、どちらの側に保存された領域に加えて30以上の塩基対を増幅するために選択する必要があります。
- 選択された配列の増幅のために我々は、タカラLA TaqTMシステムを使用してください。他のポリメラーゼは動作しますが、それは増幅中に導入されたエラーの可能性を最小限に抑えるために、校正機能を持つ酵素が含まれているミックスを使用することが重要です。我々は、アガロースゲル電気泳動によりアンプリコンのサイズを確認してください。
- 我々は、Gatewayエントリークローンを生成するために、attL組換え部位を含むエントリーベクターにPCR産物をクローン化するためのPCR 8/GW/TOPO TAクローニングキット（Invitrogen）を使用してください。クローニング反応は、新鮮なPCR産物をより効率的なので、PCRの日の内にクローン作成を実行するのが最善です。 DH5α株の形質転換は、スペクチノマイシン耐性選択に続いて実行されます。
- 我々は、インサートを解放し、アガロースゲル電気泳動によりインサートのサイズを確認するためにEcoRIでプラスミドの〜500ngの消化によってTAクローニングの製品を確認してください。我々は、挿入配列と向きを確認するための順序をお勧めします。増幅に用いたプライマーはまた、シーケンシングに使用できます。
- エントリークローンから、非コード保存配列は、ゲートウェイLR ClonaseをII酵素ミックス（Invitrogen）を用いて、私たちのゲートウェイ準備デスティネーションベクタ、pGW_cfosGFP1にLR組換えにより往復しています。 DH5α株の形質転換は、アンピシリン耐性の選択に続いて実行されます。
- 我々は、インサートを解放し、アガロースゲル電気泳動によりインサートのサイズを確認するためにEcoRVでプラスミドの〜500ngの消化によってLR組換えの製品を確認してください。正確なクローンが識別されたら、我々は、キアゲンハイスピードを使用してプラスミドDNA ®プラスミドミディキットを準備する。我々は、さらに、製造業者のプロトコルに従って、QIAクイックPCR精製キットを用いてプラスミドを精製し、30μLのRNaseフリー水でDNAを溶出させる。プラスミドは、ng /μLのと° Cの前の注射に4℃で保存されている125の濃度に希釈する。
- RNAエンコーディング機能Tol2はトランスポサーゼ酵素はpDB600 plasmid2からin vitroで転写される。我々は、キアゲンミディプレップキットを用いてプラスミドを精製し、次にXbaIで10から20μgの線形化。 mRNAの合成はmMESSAGE mMACHINEキットプロトコール（Ambion）を以下の実施しています。
- 我々は、精製し、キットの指示にしたがってRNAを沈殿させる。我々は、RNaseフリーの水に、単一の反応のための〜1μg/μl、または20μlの最終濃度にRNAを再懸濁し、そしてUV分光光度法によって定量化する。我々はまた、完全長の転写を確認するためにアガロースゲル電気泳動でRNAの〜1μgのを分析する。標準TAEまたはTBEゲルは、この分析には十分ですが、転写キットに付属の変性サンプルバッファーはキットの指示に従って使用する必要があります。
- 我々は、公知のプラスミド（図1）で注射を行うことにより有効性のためにトランスポゼースRNAのそれぞれの新しいバッチをテストします。繰り返し融解と個々のアリコートの再凍結を避けるために、検証した後、RNAを小分けに分割され、-80℃で保存。
図1。ゼブラフィッシュの胚では、コントロールとしてマウスSOX10エンハンサーを注入。（トップ ）明視野像（ 下 ）GFP蛍光像。トランスポゼースRNAのそれぞれの新しいバッチは、有効性について試験される。
2。モザイクトランスジェニック解析のためのゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション
- 我々は、無傷chorionsを貫通して、かなりシャープなテーパーとの強力なヒントを得るために設計されたプログラムで、サターP - 97マイクロピペットプラーに1.2 mm外径フィラメントガラスキャピラリーからマイクロインジェクション用の針を引き抜きます。我々は、クリーンなカミソリの刃とマイクロメータのスライドを使用して、約15μmの外径に実体顕微鏡下で手でヒントを破る。針は、注射の前に一日行われ、清潔に保つために覆われて保持皿に保存することができます。
- 我々は標準conditions3下で、光の14時間で、定期的な光暗サイクル上で私たちのゼブラフィッシュを維持する。前日に行うmicroinjectionsに、我々は小さな繁殖タンク、ベースタンクで構成されるそれぞれの、マイナスの挿入、およびプラスチックの蓋のタイミング交配のための魚を設定します。私たちは、女性3名またはt当たり2人の男性を配置平行な列にANK。
- microinjectionsの朝に、ライトサイクルが開始直後に、私たちは産卵のためにクリーンなシステム処理水に雄と雌を組み合わせる開始。それは頻繁に魚をチェックすることが重要である、とも同期バッチを取得するには、産卵の数分以内に卵を集める。産卵は朝を通して魚の新鮮なグループを結合し続けることによって、2〜3時間維持することができます。
- ラテックス電球を取り付けた"ガラスパスツールピペットを5 1 / 4、広口径で、我々は、部分的に50胚のグループでは、胚Medium2でいっぱい、60 × 15ミリメートルシャーレに採取した胚をソートし、上で収集時間をマーク各皿の蓋。
- 魚が産卵開始したら、我々は氷上でマイクロ遠心チューブに次のように混合することによって、新鮮な注射液を準備します。
コンポーネント トランスポゾンプラスミド株式（125ng/μl） 1μlの トランスポゼースRNA株式（175ng/μl） 1μlの フェノールレッドの株式（H 2 Oで2％） 0.5μl RNaseフリーの水 2.5μl
注射針は、皿を保持するに敷設し、各針のワイド端に注射溶液500 NL降下をピペッティングによって充填されています。液体が毛管作用を介して先端に描画された後、追加のソリューションは、1.5〜2μLの合計に加えることができる。私たちは、それぞれの注射液には、少なくとも2本の針を準備。 - 満たされた針を手にロードされ構成され、メーカーの指示に従って、N2のタンクに接続されて、空気圧ピコポンプまたは類似の圧力インジェクタのニードルホルダーを開催しました。我々は、マイクロスライド上にミネラルオイル中に排出された液滴の直径を測定することにより、注入量を校正する。通常は、20 psiの圧力で120ミリ秒の注入時間は約1 NLの液滴が得られますが、針直径のわずかな変化は、これらのパラメータに影響を与えますし、再校正が針の間に必要となる場合があります。
- 注射は6 - 10Xの倍率で実体顕微鏡下で実行されます。我々は、絨毛膜を通して、1つのセルまたは2セルの段階の早期での胚の卵黄への着実な圧力で注射針を押し、場所に胚を保持するために細かいピンセットを使用してください。理想的には、我々だけで割球の下に卵黄で針の先端に配置します。注射液の約1 NLを追放し、針は撤回される。それぞれのために我々は≥200胚を注入構築する。それはuninjectedコントロールの胚の料理を保存するには、収集された胚の各クラッチのため、また非常に重要です。
- 注射が完了すると我々は、未受精卵、損傷した胚、および失敗した注射（割球の無フェノールレッドを持つ胚を）除去することにより胚をソート。私たちは、その後28.5で胚の培地で胚をインキュベート° Cを観測するための適切な時間まで。
3。モザイクの発現パターンの解析
- 適切なインキュベーション時間の後、我々は、蛍光用注入胚を調べます。タイミングは、内因性ゼブラフィッシュの遺伝子の正常な発現パターンに依存しますが、我々は通常、最初の5日後に受精を介して毎日見て。
- 我々は、落射蛍光用装備オリンパスMVX10のmacroscopeに蛍光のための胚を調べていますが、低消費電力の撮影が可能な任意の同様の顕微鏡が動作します。初日に死亡または異常に開発された胚の数が多い場合、それらが正常に見えるかどうかを確認するためにそのクラッチ用uninjectedコントロールを見てください。コントロールが正常に見える場合、最も一般的な問題は、注入されたDNAの不十分な純度です。また、初期の段階で胚は、注入されたプラスミドの合計量に敏感であるので、定量が不正確だとあまりにも多くのDNAが注入された可能性があります。
- 胚を調べるとき、彼らはすべての注入構造のためのモザイクになることを覚えておいてください。それは表現の予想されるドメインが小さい場合は特に、胚のすべてにおいて慎重に検討する必要がある。また、式は動的なものであることに注意してください。1日目に強い蛍光が2日目、および式の最初の3日間4日目に何かを見せるかもしれない否定的な胚が消えることがある。
- 我々は、より広範な表現を持ついくつかの胚を選択し、顕微鏡撮影による蛍光のパターンを記録するためにこれらを使用してください。観測の5日後、胚は施設に返却されるべきであり、株式として提起。数ヶ月で、大人の導入遺伝子の生殖細胞系伝達のためにスクリーニングすることができる。
4。結果
我々は広いvを参照してください分析中のエンハンサー要素に応じてパターンと発現のレベルのariety、。我々は通常、非常に組織特異的発現パターンに興味がある、と多くの場合、スケルトンに発現する遺伝子に注目しています。そして多くの場合、スケルトンに発現する遺伝子に注目しています。図2は、我々は軟骨と骨での発現を調節するエンハンサーと、私たちの注入胚で観察されているモザイクの発現パターンの例を示します。最後に、テストシーケンスのかなりの部分は、組織特異的発現を調節しないでください。これらの場合、我々は、ほとんどの場合、おそらく非常に少ない蛍光、胚あたり散在セルを参照してください。あまり、我々は、しかし唯一の異所性発現、表皮と骨格筋（図3）の2つの一般的なサイトでは、蛍光表示される場合があります。 
図2。注入胚で観察される軟骨と骨の発現パターンの例。 
図3。遺伝子と発現調節にエンハンサーの相対的な位置の間にはほとんど相関関係があります。テストシーケンスのかなりの部分は、組織特異的発現を調節しないでください。これらは多くの場合、ほとんど蛍光を持っている、または異所性発現には2つの一般的なサイトがあります：表皮と骨格筋を。 （ トップ ）明視野像（ 下 ）GFP蛍光像。
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Discussion
我々は、ゼブラフィッシュ遺伝子組み換えを使用して潜在的なエンハンサーの効率的な分析のために我々の研究室で使用されるアプローチを示している。ほとんどの場合、我々は、ヒト遺伝子に関連付けられている組織特異的エンハンサーを探すためにこのアプローチを使用してください。人間と魚の非コード配列との間の時間の最も明白な配列相同性の欠如にもかかわらず、我々はこのアプローチは、通常、私たちに関心のある遺伝子についてはエンハンサーの同定に成功したことがわかります。成功のための重要な要因は、プラスミドDNAとトランスポゼースRNAの準備のために世話をして、そしてそれぞれのコンストラクトの胚の十分な数を注入し、検討しています。導入遺伝子構造、胚のmicroinjections、およびモザイクの発現解析の一般的な方法は、他の多くの目的のためのトランスジェニックゼブラフィッシュの行を生成するために適用できるだろう。
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Acknowledgments
我々はpDB600プラスミドの種類のプレゼントのために優れた魚の飼育用さんポーラロイ、そしてスティーブEkkerさんに感謝。これらの研究は、NHGRIからSFへの助成金によって賄われた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | |
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | |
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | |
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- The Zebrafish Book. Westerfield, M. , 3 ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (1995).
