Summary
Мы демонстрируем наш подход к поиску потенциальных элементов усилителя от умственно регулируемых генов и оценки их функции через мозаику трансгенез рыбок данио.
Abstract
Завершение геноме человека, а также многих других видов, высветил проблемы приписывая определенную функцию, не кодирующих последовательностей. Один известный функция осуществляется без кодирования долю генома состоит в регулировании транскрипции генов, однако, Есть нет эффективных методов широко предсказать цис-регуляторных элементов от первичной последовательности ДНК. Мы разработали эффективный протокол функционально оценки потенциальных цис-регуляторных элементов через данио трансгенез. Наш подход дает значительные преимущества по сравнению с клеточной культуры, основанной методы развивающих важные гены, так как он содержит информацию о пространственной и временной регуляции генов. С другой стороны, это быстрее и дешевле, чем аналогичные опыты на трансгенных мышах, и мы регулярно применять ее к последовательности изолированы от человеческого генома. Здесь мы показываем, наш подход к выбору элементов для тестирования на основе сохранения последовательности и наш протокол для клонирования последовательностей и microinjecting их в данио эмбрионов.
Protocol
1. Выбор и клонирования сохраняется последовательностей для тестирования
- Сначала нужно определить потенциальные регуляторные последовательности для функционального тестирования. Мы полагаемся на эволюционной сохранения последовательности в качестве критерия для выбора последовательности и наиболее часто используют алгоритм PhastCons, которая доступна в качестве трека на УСК браузер генома (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Однако Есть много других доступных алгоритмов для оценки последовательности сохранения разных видов.
- После того как мы выбрали наши последовательности, мы разрабатываем праймеров для амплификации каждой последовательности из геномной ДНК. Грунтовка должна быть выбрана для усиления консервативной области плюс 30 или более пар оснований с обеих сторон.
- Для усиления подобранных последовательностей мы используем Takara Л. TaqTM системы. Другие полимераз будет работать, но важно использовать смесь, которая включает в себя фермента с корректура возможность, чтобы свести к минимуму вероятность ошибок, внесенных во время усиления. Мы проверяем ампликона размер помощью электрофореза в агарозном геле.
- Мы используем ПЦР 8/GW/TOPO Т. А. Клонирование Kit (Invitrogen) для клонирования ПЦР-продукта в запись вектора, содержащего attL сайты рекомбинации, для создания клона шлюз записи. Клонирование реакция является более эффективным с свежий продукт ПЦР, так что лучше выполнять клонирование в день ПЦР. Преобразование в штаммов DH5α осуществляется с последующим отбором сопротивление спектиномицину.
- Мы проверяем продукт клонирования ТА на переваривание ~ 500ng плазмиды с EcoRI для освобождения вставки, и подтвердить размер вставки помощью электрофореза в агарозном геле. Мы рекомендовали последовательности для проверки последовательности вставки и ориентации; праймеров для амплификации могут быть также использованы для секвенирования.
- С момента вступления клон, некодирующих сохраняется последовательность курсировали рекомбинации LR нашим шлюз готовый вектор назначения, pGW_cfosGFP1, используя шлюз LR Clonase II фермента Mix (Invitrogen). Преобразование в штаммов DH5α осуществляется с последующим отбором устойчивости к ампициллину.
- Мы проверяем продукт рекомбинации LR на переваривание ~ 500ng плазмиды с EcoRV выпустить вставки, и подтвердить размер вставки помощью электрофореза в агарозном геле. После точного клона была идентифицирована, мы готовим плазмидой ДНК с использованием Qiagen HiSpeed ® плазмиды Midi Kit. Мы также очистить плазмиды использованием ПЦР Очистка QIAquick Kit, согласно протоколам производителя, и элюции ДНК с 30 мкл РНКазы воду бесплатно. Плазмиды разбавляют до концентрации 125 нг / мкл и хранили при 4 ° С до инъекций.
- РНК кодирования функциональных Tol2 транспозазы фермента транскрибируется в пробирке из pDB600 plasmid2. Мы очищаем плазмиды использованием Qiagen Midi-Prep комплект, то линеаризацию 10-20 мкг с XbaI. МРНК, синтез осуществляется следующим mMESSAGE mMACHINE Kit протокол (Амбион).
- Мы очищаем и выпадают в осадок РНК в соответствии с комплектом инструкций. Мы ресуспендирования РНК в конечной концентрации ~ 1μg/μl, или 20 мкл для одной реакции, в РНКазы свободной воды, и количественно УФ-спектрофотометрии. Мы также анализируем ~ 1 мкг РНК с помощью электрофореза в агарозном геле, чтобы проверить, насколько полно транскрипции длины. Хотя стандартный TAE или TBE геля достаточно для этого анализа, денатурирующих образец буфера входит в транскрипции комплект должен использоваться в соответствии с комплектом инструкций.
- Мы проверяем каждую новую партию транспозазы РНК на эффективность путем выполнения инъекций с известными плазмиды (рис. 1). После проверки, РНК разделяется на небольшие порции и хранят при температуре -80 ° С, чтобы избежать повторного оттаивания и замораживания отдельных аликвоты.
Рисунок 1. Данио рерио эмбрион вводят с помощью мыши Sox10 усилитель в качестве контроля. (Топ) Светлое изображение (внизу) GFP флуоресценции изображение. Каждая новая партия транспозазы РНК проверяется на эффективность.
2. Микроинъекции данио эмбрионов для мозаики трансгенных анализ
- Тянем иглы для микроинъекции от 1,2 мм Диаметр нити капиллярной стекла на Саттер Р-97 Съемник микропипетки, с программы, предназначенной для выхода сильной наконечник с довольно резким конусом проникнуть нетронутыми chorions. Разобьем подсказки руку под стереомикроскопа с внешним диаметром около 15 мкм, используя чистые лезвия бритвы и микрометра слайда. Иглы может быть сделано за день до инъекции, и хранится в закрытой проведение блюдо, чтобы содержать в чистоте.
- Мы сохраняем данио на обычном свете темно цикла, с 14 часов света при стандартных conditions3. За день до проведения микроинъекции, мы создали для рыбы приурочено вязки в небольших резервуарах разведения, каждая из которых состоит из базы танк, щелевые вставки и пластиковой крышкой. Мы размещаем три самки или два самца на тАНК параллельными рядами.
- Утром микроинъекции, вскоре после того света цикл начинается, мы начинаем объединение мужчин и женщин в чистую систему обработанной воды для производства яиц. Важно, чтобы проверить рыбу часто, и собирать яйца в течение нескольких минут после укладки, чтобы получить хорошо синхронизированы партиями. Производство яиц может поддерживаться в течение двух-трех часов, продолжая совмещать свежих групп рыб в первой половине дня.
- С широким отверстием, 5 1 / 4 "стеклянной пипетки Пастера оснащен лампой латекс, мы сортируем собранные эмбрионов в 60 х 15 мм чашки Петри, частично заполненную эмбрионов Medium2, в группах из 50 эмбрионов, и отметьте время собранные на Крышка каждого блюда.
- Как только рыба начала укладки, мы готовим свежие инъекционного раствора путем смешивания следующих в микроцентрифуге пробирку на льду:
Компонент Транспозонов плазмиды акций (125ng/μl) 1 мкл Транспозазы РНК акций (175ng/μl) 1 мкл Фенол фондовом красный (2% в H 2 O) 0.5μl РНКазы свободной воды 2.5μl
Инъекции иглами заложены в проведении блюд и заполнены с помощью пипетки 500 Нл капель раствора для инъекций на широком конце каждой иглы. После жидкости обращается на кончике через капиллярное действие, дополнительное решение может быть добавлена в общей сложности 1,5-2 мкл. Мы готовим по крайней мере двумя иглами для каждой инъекции раствора. - Заполнен иглы загружается в ручной иглы обладатель Пневматические Pico-насоса или аналогичной давления инжектор, настроить и подключить к N2 бак в соответствии с инструкциями производителя. Мы калибровки инъекции объемы путем измерения диаметра капли выбрасываются в минеральное масло на микрометр слайда. Как правило, время впрыска 120 мс при давлении 20 фунтов на квадратный дюйм даст капли около 1 п, но небольшие изменения в иглу диаметром повлияет на эти параметры и калибровка может потребоваться между иглами.
- Инъекции выполняются под стереомикроскопа на 6-10-кратным увеличением. Мы используем пару тонких щипцов для хранения эмбрионов на месте, нажмите инъекционной иглой с постоянным давлением через хориона и в желток эмбрион на одну клетку или в начале два клеточной стадии. В идеале, мы позиции иглы в желтке чуть ниже бластомеров. Приблизительно 1 п о раствор для инъекций исключен и иглы отозвано. Для каждой конструкции мы вводим ≥ 200 эмбрионов. Это также очень важно, для каждого сцепления эмбрионов собираются, чтобы сохранить блюдо uninjected эмбрионов контроля.
- После инъекции завершены мы сортируем эмбрионы, удалив неоплодотворенные яйца, повреждения эмбриона, и не инъекциями (эмбрионы, без фенола красного бластомеров). Затем мы инкубировать эмбрионов в зачаточном состоянии среды при 28,5 ° С до подходящее время для наблюдений.
3. Анализ мозаичные узоры выражение
- После соответствующего времени инкубации, мы исследуем вводят эмбрионов для флуоресценции. Времени зависит от нормальной картины выражение эндогенный ген данио, но мы обычно смотрим ежедневно через первые 5 дней после оплодотворения.
- Мы рассматриваем эмбрионов для флуоресценции от macroscope Olympus MVX10 приспособлены для epifluorescence, но любой подобный микроскоп способны низкой изображений власть будет работать. Если Есть большое количество эмбрионов, которые умерли или ненормально развитой в первый день, посмотрите на uninjected контроль за это сцепление, чтобы увидеть, если они выглядят нормально. Если элементы управления выглядят нормально, наиболее распространенной проблемой является недостаточная чистота вводили ДНК. Кроме того, эмбрионы на ранних стадиях чувствительны к общей сумме вводят плазмиды, так что вполне возможно, что количественное был неточным и слишком много ДНК вводили.
- При рассмотрении эмбрионов, имейте в виду, что все они будут мозаика для вводили конструкцию. Надо будет посмотреть внимательно на все эмбрионов, особенно если ожидается области выражении невелик. Также помните, что выражение может быть динамичной, сильной флуоресценции в 1 день может исчезнуть к 2-й день, и эмбрионов для выражения отрицательного первые 3 дня может показать что-то на 4-й день.
- Мы выбираем некоторые эмбрионы с более обширными выражения, и использовать их для документа шаблон флуоресценции photomicroscopy. После 5 дней наблюдений, эмбрионы должны быть возвращены в учреждение и вырос, как акции. Через несколько месяцев, взрослые могут пройти обследование на зародышевой линии передачи трансгенов.
4. Результаты
Мы видим широкие Variety узоров и уровень экспрессии, в зависимости от элементов усилителя анализируются. Мы, как правило, заинтересованы в ткани очень конкретных моделей выражения, и часто с акцентом на гены выражены в скелете. и часто с акцентом на гены выражены в скелете. На рисунке 2 показаны примеры мозаичные узоры выражение мы наблюдали в нашей вводят эмбрионы, с усилителями регулирующие выражение в хрящи и кости. Наконец, значительная часть протестированных последовательностей не регулируют ткани конкретное выражение. Для них мы чаще всего видим очень мало флуоресценции, возможно, несколько разрозненных ячеек в зародыше. Реже, мы могли бы видеть флуоресценции, но только в двух общих мест для эктопической экспрессии, эпидермиса и скелетных мышц (рис. 3). 
Рисунок 2. Пример хрящевой и костной выражения, наблюдаемую в вводили эмбрионов. 
Рисунок 3. Существует незначительная связь между расположение относительной усилитель для генов и регуляции экспрессии. Значительную часть протестированных последовательностей не регулируют ткани конкретное выражение. Они часто имеют очень мало флуоресценции, или может иметь две общие сайты для внематочная выражение: эпидермис и скелетных мышцах. (Вверху) Светлое изображение (внизу) GFP флуоресценции изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы показали, подход, используемый в нашей лаборатории для эффективного анализа потенциальных усилителей использованием данио трансгенез. Чаще всего мы используем этот подход, чтобы искать тканеспецифические усилители связанные с человеческими генами. Несмотря на отсутствие очевидных гомологическая последовательность большую часть времени между человеком и рыбой некодирующих последовательностей, мы находим, что этот подход, как правило, успешными в определении усилители для гены, представляющие интерес для нас. Критические факторы успеха заботятся в подготовке плазмидной ДНК и РНК транспозазы, и потребителей инъекционных и изучения достаточного количества эмбрионов для каждой конструкции. Общие методы трансгенов строительства, эмбрион микроинъекции, а также анализ мозаики выражения были бы применимы к генерации трансгенных линий данио для многих других целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим г-жа Паула Рой за отличную хозяйства рыба, и Стив Ekker для рода даром pDB600 плазмиды. Эти исследования были профинансированы за счет гранта в СФ от NHGRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | |
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | |
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | |
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- The Zebrafish Book. Westerfield, M. , 3 ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (1995).
