فسيفساء Transgenesis اسماك الزرد لتقييم متواليات محسن

Summary

نظهر نهجنا لإيجاد العناصر المحتملة محسن من الجينات تنظم تنمويا وتقييمها من خلال وظيفتها transgenesis الزرد الفسيفساء.

Abstract

وقد سلط الضوء على الانتهاء من تسلسل الجينوم البشري ، مع أن الكثير من الأنواع الأخرى ، والتحدي المتمثل في وظيفة محددة يرجع إلى عدم تسلسل الترميز. وظيفة واحدة بارزة نفذتها الكسر غير الترميز من الجينوم هو تنظيم النسخ الجيني ، ولكن لا توجد وسائل فعالة للتنبؤ على نطاق واسع مقرون التنظيم عناصر من تسلسل الحمض النووي الرئيسي. قمنا بتطوير بروتوكول لتقييم كفاءة من الناحية الوظيفية المحتملة مقرون عناصر التنظيم من خلال transgenesis الزرد. نهجنا يقدم مزايا هامة على خلية ثقافة تقنيات استنادا للجينات هامة تنمويا ، نظرا لأنه يقدم معلومات عن تنظيم الجينات المكانية والزمانية. على العكس ، هو أسرع وأقل تكلفة من التجارب المماثلة في الفئران المعدلة وراثيا ، ونحن نطبق بشكل روتيني لمتواليات معزولة عن الجينوم البشري. هنا نظهر نهجنا في اختيار عناصر لاختبار القائمة على الحفاظ على تسلسل وبروتوكول لدينا تسلسل الاستنساخ وmicroinjecting لهم في الأجنة الزرد.

Protocol

1. اختيار واستنساخ تسلسل حفظها للاختبار

1. يجب على المرء أولا تحديد متواليات التنظيمية المحتملة لاختبار وظيفية. نحن نعتمد على الحفاظ على التسلسل التطوري كمعيار لتحديد متواليات ، وغالبا ما تستخدم PhastCons الخوارزمية ، الذي هو في متناول الجميع باعتباره المسار على متصفح الجينوم UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). ومع ذلك ، هناك العديد من الخوارزميات الأخرى المتاحة لتقييم الحفظ عبر تسلسل الأنواع.
2. مرة واحدة لدينا تحديد تسلسل لدينا ، ونحن تصميم الاشعال لتضخيم كل تسلسل الحمض النووي من الجيني. وينبغي اختيار الاشعال لتضخيم المنطقة بالاضافة الى الحفاظ أزواج قاعدة 30 أو أكثر على أي من الجانبين.
3. عن التضخيم من متواليات اخترنا استخدام نظام تاكارا TaqTM لوس انجليس. سوف polymerases الأعمال الأخرى ، ولكن من المهم أن استخدام مزيج يتضمن انزيم مع القدرة على تصحيح التجارب المطبعية ، لتقليل فرص الأخطاء التي أدخلت خلال التضخيم. علينا التحقق من حجم amplicon بواسطة agarose هلام إستشراد.
4. نستخدم 8/GW/TOPO PCR TA الاستنساخ كيت (Invitrogen) لاستنساخ منتج PCR إلى مواقع تحتوي على دخول ناقلات attL إعادة التركيب ، لإنشاء بوابة دخول استنساخ. رد فعل الاستنساخ هو أكثر كفاءة مع المنتج PCR جديدة ، لذلك فمن الأفضل لأداء الاستنساخ خلال يوم واحد من PCR. يتم تنفيذ التحول في سلالات DH5α تليها اختيار المقاومة سبكتينوميسين.
5. علينا التحقق من نتاج الاستنساخ بواسطة TA هضم ~ 500ng من البلازميد مع EcoRI للافراج عن إدراج ، وتأكيد حجم إدراج بواسطة agarose هلام إستشراد. أوصينا تسلسل للتحقق من إدراج تسلسل والتوجيه ؛ ويمكن أيضا استخدامه لتضخيم الاشعال تستعمل لأجل التسلسل.
6. استنساخ من الدخول ، وزيارات مكوكية تسلسل غير الترميز التي تحفظها تأشب LR لدينا ناقلات الوجهة عبارة جاهزة ، pGW_cfosGFP1 ، وذلك باستخدام عبارة LR Clonase الثاني انزيم ميكس (Invitrogen). يتم تنفيذ التحول في سلالات DH5α تليها اختيار المقاومة أمبيسيلين.
7. علينا التحقق من نتاج إعادة التركيب من قبل LR هضم ~ 500ng من البلازميد مع EcoRV للافراج عن إدراج ، والتأكد من حجم إدراج بواسطة agarose هلام إستشراد. مرة واحدة وقد تم استنساخ رصدوا دقيقة ، ونحن نستعد DNA البلازميد باستخدام HiSpeed ​​Qiagen ® مجموعة ميدي البلازميد. ونحن كذلك تنقية البلازميد باستخدام تنقية PCR QIAquick كيت ، وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة ، وأزل الحمض النووي مع 30 ميكرولتر ريبونوكلياز المياه مجانا. وتضعف البلازميد إلى تركيز من 125 نانوغرام / ميكرولتر وتخزينها في 4 درجات مئوية قبل الحقن.
8. هو كتب الحمض النووي الريبي الترميز الفنية انزيم transposase Tol2 في المختبر من plasmid2 pDB600 و. نحن تنقية البلازميد باستخدام لوار الإعدادية Qiagen عدة ، ثم يصبح خطي 10-20 ميكروغرام مع XbaI. ويتم تجميع مرنا في أعقاب بروتوكول mMESSAGE كيت mMACHINE (Ambion).
9. يمكننا تطهير وترسيب الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الطقم. resuspend نحن RNA إلى التركيز النهائي لل1μg/μl ~ ، أو 20 ميكرولتر عن رد فعل واحد ، في الماء ريبونوكلياز الحرة ، وتحديد القياس الطيفي بواسطة الأشعة فوق البنفسجية. نحن نحلل أيضا ~ 1μg من الحمض النووي الريبي التي agarose هلام إستشراد للتحقق من النسخ الكاملة الطول. على الرغم من أن تاي القياسية أو هلام TBE غير كافية لهذا التحليل ، ينبغي أن تستخدم في تغيير طبيعة وشملت عينة العازلة مع عدة نسخ وفقا لتعليمات الطقم.
10. علينا اختبار كل دفعة جديدة من الحمض النووي الريبي لtransposase فعالية عن طريق إجراء عمليات الحقن التي تحتوي على (الشكل 1) البلازميد معروفة. بعد التحقق ، ينقسم الحمض النووي الريبي في aliquots الصغيرة وتخزينها في -80 درجة مئوية ، لتجنب تكرار وذوبان refreezing من aliquots الفردية.
    
    الشكل 1. الزرد الجنين حقنوا محسن Sox10 الماوس كعنصر تحكم (الأعلى) Brightfield صورة (القاع) GFP مضان الصورة. يتم اختبار كل دفعة جديدة من الحمض النووي الريبي لtransposase الفعالية.

2. Microinjection الأجنة الزرد لتحليل الفسيفساء المعدلة وراثيا

1. نحن لسحب الإبر microinjection من 1.2 ملم خيوط الزجاج OD الشعرية على بولير P - 97 Micropipette سوتر ، مع برنامج مصمم لانتاج تلميح قوي مع تفتق حاد نوعا ما على اختراق chorions سليمة. علينا كسر نصائح باليد تحت stereomicroscope إلى القطر الخارجي حوالي 15 ميكرون ، وذلك باستخدام شفرة حلاقة نظيفة وشريحة ميكرون. ويمكن إجراء هذه الإبر في اليوم قبل الحقن ، وتخزينها في صحن عقد مغطاة للحفاظ على نظافة.
2. نحافظ على موقعنا في الزرد دورة العادية ضوء الظلام ، مع 14 ساعة من الضوء ، في إطار conditions3 القياسية. في اليوم قبل أداء microinjections ، أنشأنا الأسماك للتزاوج موقوتة في خزانات تربية صغيرة ، كل منها يتكون من خزان القاعدة ، وإدراج فترة زمنية محددة ، وغطاء بلاستيكي. نضع ثلاث إناث أو اثنين من الذكور لكل طنكرانك في صفوف متوازية.
3. في صباح يوم من microinjections ، وبعد فترة وجيزة من بدء دورة الضوء ، ونحن نبدأ الجمع بين الذكور والإناث في نظام المياه المعالجة النظيفة لإنتاج البيض. فمن المهم للاطمئنان على الأسماك في كثير من الأحيان ، وجمع البيض في غضون بضع دقائق من زرع ، للحصول على دفعات تتزامن أيضا. يمكن الحفاظ على إنتاج البيض لمدة سنتين إلى ثلاث ساعات ، من خلال الاستمرار في الجمع بين مجموعات من الأسماك الطازجة في جميع أنحاء الصباح.
4. مع تجويف واسع ، 5 1 / 4 "زجاج باستور ماصة مزودة مبة اللاتكس ، ونحن فرز الأجنة التي تم جمعها في 60 × 15 مم أطباق بتري ، ملأ جزئيا مع Medium2 الأجنة ، في مجموعات من 50 الأجنة ، وعلامة في الوقت التي يتم جمعها على غطاء كل طبق.
5. السمك مرة واحدة بدأت زرع ، ونحن نستعد الطازجة حل حقن عن طريق المزج ما يلي في أنبوب microfuge على الجليد :

   مكون
   ينقول الأسهم البلازميد (125ng/μl)	1μl
   Transposase RNA الأسهم (175ng/μl)	1μl
   الفينول الأسهم الحمراء (2 ٪ في H 2 O)	0.5μl
   ريبونوكلياز المياه مجانا	2.5μl

   
   وضعت الإبر الحقن في عقد الأطباق ويشغلها pipetting 500 قطرات من محلول الحقن NL على نطاق واسع في نهاية كل إبرة. بعد يوجه السائل إلى غيض من خلال العمل الشعري ، ويمكن أن تضاف إلى حل إضافية مجموعه 1،5-2 ميكرولتر. نحن نستعد اثنين على الاقل من الإبر لكل حل الحقن.
6. يتم تحميل شغل الإبرة في ناحية عقد الإبرة حامل بيكو مضخة هوائية أو ما شابه ذلك حاقن الضغط ، وتكوين وتوصيلها إلى خزان N2 فقا لتعليمات الشركة الصانعة. نحن معايرة حقن كميات من خلال قياس قطرها من قطرات الزيت المعدني في طرد على شريحة ميكرون. عادة ، فإن الوقت حقن 120 مللي مع ضغط 20 رطل العائد قطرات من حوالي 1 NL ، ولكن هناك اختلافات طفيفة في إبرة قطرها سوف تؤثر هذه المعايير ، ويمكن إعادة تقويم المطلوبة بين الإبر.
7. يتم تنفيذ عمليات الحقن تحت stereomicroscope في 6 - 10X التكبير. علينا استخدام زوج من غرامة ملقط لعقد الجنين في مكان ، ودفع الإبرة الحقن مع الضغط المستمر من خلال المشيماء والمح الى وجود الجنين في خلية واحدة أو المرحلة المبكرة من الخلايا اثنين. من الناحية المثالية ، ونحن موقف الطرف إبرة في صفار البيض فقط دون blastomeres. وطرد ما يقرب من 1 NL حل الحقن وسحب الإبرة. لكل بناء نحن حقن ≥ 200 الأجنة. بل هو أيضا مهم جدا ، بالنسبة لكل مخلب الأجنة التي تم جمعها ، لإنقاذ طبق من الأجنة uninjected السيطرة.
8. بعد الانتهاء من حقن نحن فرز الأجنة عن طريق إزالة بويضة غير مخصبة والأجنة التالفة ، والحقن الفاشلة (مع عدم وجود أجنة أحمر الفينول في blastomeres). نحن احتضان ثم الأجنة في المتوسط ​​28.5 في جنين درجة مئوية حتى الوقت المناسب للملاحظات.

3. تحليل أنماط التعبير الفسيفساء

1. بعد فترة حضانة مناسبة ، ونحن فحص الأجنة لحقن مضان. توقيت يعتمد على نمط التعبير العادية من الجين الزرد الذاتية ، ولكن نحن ننظر عادة يومية من خلال أول 5 أيام الإخصاب آخر.
2. ندرس الأجنة لمضان على macroscope MVX10 أوليمبوس المجهزة لepifluorescence ، ولكن أي المجهر مماثلة قادرة على التصوير منخفضة الطاقة والعمل. إذا كان هناك عدد كبير من الأجنة التي وضعت بشكل غير طبيعي أو توفي في اليوم الأول ، أن ننظر في uninjected ضوابط لهذا مخلب لمعرفة إذا كانت تبدو طبيعية. إذا كانت الضوابط تبدو عادية ، والمشكلة الأكثر شيوعا هو نقاء كافية من الحمض النووي حقن. أيضا ، الأجنة في المراحل المبكرة حساسة لالمبلغ الإجمالي للبلازميد حقن ، ولذلك فمن الممكن أن تقدير غير دقيق وتم حقن الدنا كثيرا.
3. عند فحص الأجنة ، أن نضع في اعتبارنا أن سيكونون جميعا في فسيفساء لبناء حقن. وسوف يكون من الضروري أن ننظر بعناية في كل من الأجنة ، وخاصة إذا كان من المتوقع المجال للتعبير صغير. نتذكر أيضا أن التعبير يمكن أن تكون دينامية ؛ مضان قوية يوم 1 قد يختفي بحلول يوم 2 ، والأجنة السلبية للتعبير عن أول 3 ايام قد تظهر شيئا في يوم 4.
4. نختار بعض الأجنة مع التعبير أكثر اتساعا ، واستخدام هذه الوثيقة لنمط مضان بواسطة تصوير مجهري. بعد 5 أيام من الملاحظات ، ينبغي إرجاع الأجنة إلى المرفق ونشأ الأسهم. في عدة أشهر ، يمكن فرزهم من البالغين لإحالته germline من الجينات المحورة.

4. النتائج

نرى الخامس واسعةariety أنماط ومستويات التعبير ، واعتمادا على العنصر محسن يجري تحليلها. نحن مهتمون عادة في أنماط التعبير الأنسجة جدا محددة ، وغالبا ما يركزون على الجينات التي أعرب عنها في الهيكل العظمي. وغالبا ما يركزون على الجينات التي أعرب عنها في الهيكل العظمي. ويبين الشكل 2 أمثلة لأنماط التعبير الفسيفساء لاحظناه في الأجنة لدينا حقن ، مع القدرة على تنظيم التعبير في الغضاريف والعظام. أخيرا ، وجزء كبير من تسلسل اختبار لا تنظم التعبير أنسجة معينة. لهؤلاء ، ونحن غالبا ما نرى مضان القليل جدا ، وربما بضع خلايا منتشرة في جنين. أقل في كثير من الأحيان ، قد نرى مضان ، ولكن فقط في موقعين مشتركة للتعبير خارج الرحم ، والبشرة والعضلات والهيكل العظمي (الشكل 3).

الشكل 2. مثال على أنماط التعبير الغضاريف والعظام التي لوحظت في الأجنة المحقونة.

الشكل 3. هناك ارتباط كبير بين مكان قريب محسن لهذا الجين والتنظيم والتعبير. جزء كبير من تسلسل اختبار لا تنظم التعبير أنسجة معينة. هذه غالبا ما يكون مضان قليلا جدا ، أو قد يكون موقعين مشتركة للتعبير خارج الرحم : البشرة والعضلات والهيكل العظمي. (الأعلى) Brightfield صورة صورة GFP (القاع) مضان.

Discussion

وقد برهنا على النهج المستخدمة في المختبر لدينا لتحليل كفاءة القدرة على احتمال استخدام transgenesis الزرد. في معظم الأحيان ، ونحن نستخدم هذا النهج للبحث عن الأنسجة الخاصة والقدرة على الجينات البشرية المرتبطة. على الرغم من عدم وجود تسلسل واضح تناظر معظم الوقت بين الإنسان والأسماك غير الترميز متواليات ، نجد أن هذا النهج هو عادة القدرة على النجاح في تحديد الجينات للاهتمام بالنسبة لنا. العوامل الحاسمة للنجاح هي العناية في التحضير للحمض النووي الريبي البلازميد وtransposase ، والحقن وفحص عدد كاف من الأجنة لكل بناء. فإن أساليب البناء العام للالتحوير ، microinjections الجنين ، وفسيفساء تحليل التعبير تنطبق على خطوط توليد الزرد المعدلة وراثيا لأغراض أخرى كثيرة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Takara LA Taq	Takara Bio Inc	RR02M
pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit	Invitrogen	K2500-20
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen	11791-100
Library efficiency competent cells DH5α	Invitrogen	12535-019
Library efficiency competent cells DB3.1	Invitrogen	11782-018
mMESSAGE mMACHINE Kit	Ambion	AM1340
HiSpeed Plasmid Midi Kit	Qiagen	12643
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820