Summary
Demostramos nuestro enfoque a la búsqueda de posibles elementos potenciadores de los genes de desarrollo regulado y la evaluación de su función a través de la transgénesis mosaico de pez cebra.
Abstract
La finalización de la secuencia del genoma humano, junto con la de muchas otras especies, ha puesto de relieve el desafío de atribuir funciones específicas a la no codificación de secuencias. Una de las funciones destacadas llevadas a cabo por la fracción no codificantes del genoma es la de regular la transcripción de genes, sin embargo, no existe ningún método eficaz para predecir ampliamente cis-elementos reguladores de la secuencia primaria del ADN. Hemos desarrollado un protocolo eficaz para evaluar funcionalmente posibles elementos reguladores cis-a través de la transgénesis de pez cebra. Nuestro enfoque ofrece ventajas significativas sobre las técnicas de cultivo celular basada en los genes de desarrollo importantes, ya que proporciona información sobre la regulación genética espacial y temporal. Por el contrario, es más rápido y menos costoso que experimentos similares en ratones transgénicos, y que habitualmente se aplica a las secuencias aisladas del genoma humano. Aquí demostramos nuestro enfoque a la selección de los elementos de prueba sobre la base de la secuencia de conservación y el protocolo para las secuencias de la clonación y la microinyección en embriones de pez cebra.
Protocol
1. Selección y la clonación de secuencias conservadas para las pruebas
- Primero hay que identificar las posibles secuencias reguladoras de las pruebas funcionales. Contamos con la conservación de una secuencia evolutiva como un criterio para seleccionar las secuencias, y la mayoría utilizan a menudo el PhastCons algoritmo, que es accesible como una pista en la UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Sin embargo, hay muchos otros algoritmos disponibles para evaluar la secuencia de conservación entre las especies.
- Una vez que hayamos seleccionado a nuestro secuencias, diseño de cebadores para amplificar cada secuencia de ADN genómico. Cebadores deben ser seleccionados para amplificar la región conservada más 30 o más pares de bases a cada lado.
- Para la amplificación de las secuencias seleccionadas se utiliza el sistema de Takara LA TaqTM. Otras polimerasas va a funcionar, pero es importante utilizar una mezcla que incluye una enzima con capacidad de corrección de pruebas, para reducir al mínimo las posibilidades de errores introducidos durante la amplificación. Verificamos el tamaño de amplificación por electroforesis en gel de agarosa.
- Nosotros usamos la PCR 8/GW/TOPO TA Clonación Kit (Invitrogen) para clonar el producto de PCR en un vector de entrada que contiene los sitios attL recombinación, para generar el clon de la entrada de puerta de enlace. La reacción de la clonación es más eficiente con el nuevo producto de la PCR, lo que es mejor para llevar a cabo la clonación en un día de la PCR. Transformación de las cepas se realiza DH5a seguido por la selección resistencia a la espectinomicina.
- Se verifica que el producto de la clonación TA por digestión de ~ 500 ng del plásmido con EcoRI para liberar la pieza, y confirmar el tamaño de la pieza por electroforesis en gel de agarosa. Se recomienda la secuenciación para verificar la secuencia de inserción y orientación; cebadores utilizados para la amplificación también puede ser utilizado para la secuenciación.
- Desde el clon de la entrada, la secuencia no codificadora se conserva transportados por recombinación LR en nuestro vector de puerta de enlace destino listo, pGW_cfosGFP1, con puerta de enlace LR Clonase II de la enzima Mix (Invitrogen). Transformación de las cepas se realiza DH5a seguido por la selección de resistencia a ampicilina.
- Se verifica que el producto de la recombinación LR por la digestión de ~ 500 ng del plásmido con EcoRV para liberar el inserto, y confirmar el tamaño de la pieza por electroforesis en gel de agarosa. Una vez que un clon exacto ha sido identificado, nos preparamos con el ADN del plásmido HiSpeed Qiagen ® Kit Midi plásmido. Estamos más purificar el plásmido con el Kit QIAquick PCR Purificación, de acuerdo a los protocolos del fabricante, y eluir el ADN con 30 l RNasa libre de agua. El plásmido se diluye a una concentración de 125 ng / mL y almacenadas a 4 ° C antes de las inyecciones.
- ARN que codifican funcional Tol2 enzima transposasa se transcribe in vitro de la pDB600 plasmid2. Podemos purificar el plásmido con el Qiagen Midi-Prep kit, y luego alinear 10-20 mg con XbaI. La síntesis de ARNm se lleva a cabo siguiendo el protocolo mMESSAGE mMACHINE Kit (Ambion).
- Nos purifica y precipitar el ARN de acuerdo con las instrucciones del kit. Nos resuspender ARN a una concentración final de ~ 1μg/μl, o 20 l para una sola reacción, en RNasa libre de agua, y cuantificar mediante espectrofotometría UV. Asimismo, se analizan ~ 1 g de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa para verificar la transcripción de larga duración. A pesar de un estándar de TAE o TBE gel es adecuado para este análisis, la muestra de amortiguación desnaturalización incluido en el kit de transcripción se debe utilizar de acuerdo a las instrucciones del kit.
- Probamos cada nuevo lote de transposasa de ARN para la eficacia mediante la realización de inyecciones con un conocido plásmido (Figura 1). Tras la verificación, el ARN se divide en pequeñas partes alícuotas y almacenados a -80 ° C, para evitar la descongelación repetida y volver a congelar de alícuotas individuales.
Figura 1. Embrión de pez cebra inyectados con el potenciador del ratón SOX10 como control. (Arriba) imagen campo claro (inferior) de imágenes de fluorescencia de GFP. Cada nuevo lote de transposasa ARN es la prueba de la eficacia.
2. Microinyección de embriones de pez cebra para el análisis de mosaico transgénicos
- Tiramos las agujas para la microinyección de 1,2 mm de diámetro exterior de vidrio de filamento capilar en un Sutter P-97 Extractor Micropipeta, con un programa diseñado para dar un consejo fuerte, con una inclinación bastante agudo para penetrar coriones intacto. Rompemos las puntas a mano bajo un microscopio estereoscópico a un diámetro exterior de aproximadamente 15 micras, con una cuchilla limpia y un tobogán de micrómetro. Las agujas se puede hacer el día antes de las inyecciones, y se almacena en un plato de explotación objeto de mantener limpio.
- Mantenemos nuestro pez cebra en un ciclo regular oscura luz, con 14 horas de luz, bajo la norma conditions3. El día antes de la realización de microinyecciones, hemos creado la pesca de apareamientos tiempo en los tanques de cría de pequeños, cada uno con un tanque de base, una inserción de ranuras, y una tapa de plástico. Ponemos tres hembras y dos machos por tank en filas paralelas.
- En la mañana de la micro-inyecciones, poco después comienza el ciclo de luz, comenzamos la combinación de hombres y mujeres en la limpieza del sistema de agua tratada para la producción de huevos. Es importante comprobar el pescado con frecuencia, y recoger los huevos en unos pocos minutos de la puesta, para obtener lotes bien sincronizada. La producción de huevos se puede mantener durante dos o tres horas, al continuar combinar nuevos grupos de peces a lo largo de la mañana.
- Con una amplia gama de diámetro, 5 1 / 4 "pipeta Pasteur de vidrio provista de un bulbo de látex, que ordenar los embriones obtenidos en 60 x 15 mm platos Petri, parcialmente lleno de embriones Medium2, en grupos de 50 embriones, y marcar el tiempo de recogida de la tapa de cada plato.
- Una vez que los peces han comenzado a sentar, preparamos una solución nueva inyección mediante la mezcla de lo siguiente en un tubo de microcentrífuga en hielo:
Componente Transposón plásmido de acciones (125ng/μl) 1μl Transposasa ARN de acciones (175ng/μl) 1μl Fenol sangre roja (2% en H 2 O) 0.5μl RNasa libre de agua 2.5μl
Las agujas de inyección se colocan en la celebración de los platos y cubiertos por pipeteo 500 gotas nl de solución inyectable en el extremo ancho de cada aguja. Después de que el líquido se extrae a la punta por capilaridad, la solución adicional puede ser añadido a un total de 1,5 a 2 l. Nos preparamos por lo menos dos agujas para cada solución de la inyección. - La aguja llena se carga en la mano porta-agujas de un neumático Pico-bomba o similares en la presión de inyección, configurada y conectada a un tanque de N2 por las instrucciones del fabricante. Nos calibrar el volumen de inyección, midiendo el diámetro de las gotas expulsadas al aceite mineral sobre un portaobjetos de micrómetro. Por lo general, un tiempo de inyección de 120 ms con una presión de 20 psi dará lugar a una gota de aproximadamente 1 nl, pero pequeñas variaciones en la aguja de diámetro afectará a estos parámetros y calibración puede ser necesaria entre las agujas.
- Las inyecciones se realizan bajo un microscopio estereoscópico a las 6-10X de aumento. Nosotros usamos un par de pinzas finas para retener el embrión en su lugar, introducir la aguja de la inyección con una presión constante a través del corion y en la yema de un embrión en la celda de uno o dos primeras etapas de la célula. Lo ideal es que la posición de la punta de la aguja en la yema justo por debajo de los blastómeros. Aproximadamente 1 nl de solución inyectable es expulsado y se retira la aguja. Para construir cada uno se inyecta ≥ 200 embriones. También es muy importante, para cada nidada de embriones, para salvar a un plato de control de los embriones inyectados.
- Después de las inyecciones que se han completado ordenar los embriones mediante la eliminación de huevos no fecundados, embriones dañados, y las inyecciones no (embriones sin rojo de fenol en blastómeros). A continuación, se incuban los embriones en un medio de embrión a 28,5 ° C hasta el momento apropiado para la observación.
3. Análisis de patrones de expresión del mosaico
- Después de un tiempo de incubación adecuado, se examinan los embriones inyectados por fluorescencia. El tiempo dependerá del patrón de expresión normal del gen del pez cebra endógena, pero generalmente se ven todos los días durante los primeros 5 días después de la fecundación.
- Se examinan los embriones de fluorescencia en un macroscopio Olympus MVX10 equipado para epifluorescencia, pero cualquier microscopio capaz de obtener imágenes similares bajo consumo de energía va a funcionar. Si hay un gran número de embriones que mueren o un desarrollo anormal en el primer día, mira los controles no inyectados para que el embrague para ver si se ven normales. Si los controles de aspecto normal, el problema más común es la pureza insuficiente del ADN inyectado. Además, los embriones en las primeras etapas son sensibles a la cantidad total de plásmido se inyecta, por lo que es posible que la cuantificación es inexacta y el ADN se inyecta demasiado.
- Al examinar los embriones, tenga en cuenta que todos ellos serán de mosaico para la construcción de inyección. Será necesario examinar cuidadosamente todos los embriones, sobre todo si el dominio esperado de expresión es pequeño. También recuerda que la expresión puede ser dinámico, fuerte fluorescencia en el día 1 podrían desaparecer para el día 2, y los embriones negativos para la expresión de los 3 primeros días podrían mostrar algo en el día 4.
- Hemos escogido algunos embriones con la expresión más amplia, y el uso de estos para documentar el patrón de fluorescencia por photomicroscopy. Después de 5 días de observaciones, los embriones deben ser devueltos a las instalaciones y se crió en una población. En varios meses, los adultos pueden ser examinados para la transmisión de la línea germinal de los transgenes.
4. Resultados
Vemos una gran variedad de los patrones y los niveles de expresión, según el elemento potenciador que se analiza. Por lo general estamos muy interesados en los patrones de expresión específica de tejido, y con frecuencia se centra en los genes expresados en el esqueleto. y con frecuencia se centra en los genes expresados en el esqueleto. La figura 2 muestra ejemplos de los patrones de expresión de mosaico que hemos observado en nuestros embriones inyectados, con potenciadores de regulación de la expresión en el cartílago y el hueso. Finalmente, una parte sustancial de las secuencias de prueba no regulan la expresión específica de tejido. Para estos, la mayoría ven a menudo fluorescencia muy poco, tal vez unas pocas células esparcidas por embrión. Con menos frecuencia, podríamos ver la fluorescencia, pero sólo en dos sitios comunes para la expresión ectópica, la epidermis y el músculo esquelético (Figura 3). 
Figura 2. Ejemplo de patrones de expresión de cartílago y hueso observados en los embriones inyectados. 
Figura 3. Hay poca correlación entre la ubicación de la relación potenciador de la regulación de genes y de expresión. Una parte sustancial de las secuencias de prueba no regulan la expresión específica de tejido. Estos a menudo tienen fluorescencia muy poco, o tener dos sitios comunes para la expresión ectópica: la epidermis y el músculo esquelético. (Arriba) imagen campo claro (abajo) la fluorescencia de GFP de la imagen.
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Discussion
Hemos demostrado el método utilizado en nuestro laboratorio para el análisis eficiente de los potenciadores del potencial uso de la transgénesis de pez cebra. Muy a menudo, se utiliza este método para buscar tejido-específica potenciadores asociados con genes humanos. A pesar de la falta de homología de secuencia más evidente de la época entre los humanos y los peces secuencias no codificantes, nos encontramos con que este enfoque suele tener éxito en la identificación de los potenciadores de los genes de interés para nosotros. Los factores críticos de éxito son el cuidado en la preparación del plásmido de ADN y el ARN transposasa, y la inyección y el examen de un número suficiente de embriones para cada construcción. Los métodos generales de la construcción transgénica, microinyecciones de embriones, y análisis de la expresión del mosaico sería aplicable a la generación de líneas transgénicas de pez cebra para muchos otros fines.
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Acknowledgments
Agradecemos a la Sra. Paula Roy para la cría de peces de excelente, y Steve Ekker para el tipo de regalo el plásmido pDB600. Estos estudios fueron financiados por una donación a San Francisco de NHGRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | |
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | |
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | |
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- The Zebrafish Book. Westerfield, M. , 3 ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (1995).
