Summary
Biz, gelişimsel olarak düzenlenir genleri potansiyel artırıcı unsurları bulma ve mozaik zebrafish transgenesis fonksiyonu değerlendirmede bizim yaklaşımımız göstermektedir.
Abstract
, Pek çok diğer türler ile birlikte insan genom dizisinin tamamlanması, belirli bir işlevi olmayan kodlama dizileri vermenin zorluk ön plana çıkarmıştır. Bir genomun olmayan kodlama fraksiyonu tarafından yürütülen önemli bir fonksiyonu gen transkripsiyonu düzenleyen, ancak genel olarak birincil DNA dizisi cis-düzenleyici unsurları tahmin etmek için etkili yöntemler vardır. Biz zebrafish transgenesis aracılığıyla potansiyel cis-düzenleyici unsurlar işlevsel değerlendirmek için verimli bir protokol geliştirmiştir. Bizim yaklaşımımız, mekansal ve zamansal gen regülasyonu hakkında bilgi sağlar, gelişimsel olarak önemli genler hücre kültür teknikleri üzerinde önemli avantajlar sunuyor. Tersine, transgenik farelerin benzer deneyler daha hızlı ve daha az pahalı ve rutin insan genomu izole dizileri uygulayabilirsiniz. Burada sıra koruma ve klonlama dizileri için bizim protokol tabanlı ve zebrafish embriyolar içine microinjecting test etmek için eleman seçerken bizim yaklaşım göstermektedir.
Protocol
1. Seçme ve test etmek için korunmuş dizilerinin klonlanması
- Bir ilk fonksiyonel testleri için potansiyel düzenleyici dizileri tanımlamak gerekir. Biz dizileri seçmek için bir kriter olarak evrimsel bir sıralama koruma güveniyor ve en sık UCSC Genom tarayıcı (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway) bir parça olarak erişilebilir algoritma PhastCons kullanabilirsiniz. Ancak, türler arasında sırası koruma değerlendirmek için pek çok diğer algoritmaları vardır.
- Bir kere biz bizim dizileri seçtiniz, biz her genomik DNA sırasını yükseltmek için primerler dizayn. Astarlar korunmuş bölgenin her iki tarafında bulunan artı 30 veya daha fazla baz çifti yükseltmek için seçilmiş olmalıdır.
- Seçilen dizilerinin amplifikasyonu için Takara LA TaqTM sistemi kullanır. Diğer polimerazları çalışır, ama amplifikasyon sırasında tanıtılan hataları şansını en aza indirmek için, redaksiyon yeteneğine sahip bir enzim içeren bir karışım kullanmak önemlidir. Biz agaroz jel elektroforezi ile Amplikon boyutu olun.
- Biz PCR 8/GW/TOPO TA Klonlama Kiti (Invitrogen) attL rekombinasyon siteleri içeren bir giriş vektörü PCR ürünü clone Gateway giriş klon oluşturmak için kullanın. Klonlama tepki taze PCR ürünü ile daha verimli, böylece bir gün içinde PCR klonlama gerçekleştirmek için en iyisidir. DH5α suşları Dönüşüm spectinomycin direnç seçimi yapılır.
- Biz insert serbest EcoRI ile plazmid ~ 500ng sindirim TA klonlama ürün doğrulamak ve agaroz jel elektroforezi ile ekleme boyutunu onaylayın. Biz ekleme sırası ve yönünü kontrol etmek için sıralama önerilir; amplifikasyonu için kullanılan primerler sıralaması için de kullanılıyor olabilir.
- Giriş klon olmayan kodlama korunmuş dizisi Gateway LR Clonase II enzim Mix (Invitrogen) kullanarak Ağ Geçidi hazır hedef vektörü, pGW_cfosGFP1, LR rekombinasyon mekik. Dönüşüm DH5α suşlarının ampisilin direnç seçimi yapılır.
- Biz insert serbest EcoRV ile plazmid ~ 500ng sindirim LR rekombinasyon ürünü doğrulamak ve agaroz jel elektroforezi ile ekleme boyutunu onaylayın. Doğru bir klon tespit edildikten sonra, biz Qiagen HiSpeed kullanarak plazmid DNA ® Plazmid Midi Kit hazırlar. Üreticinin protokollere göre daha QIAquick PCR Arıtma Kit kullanarak plazmid arındırmak ve 30 mcL RNaz ücretsiz su ile DNA Zehir. Plazmid 125 mcL ng / 4 saklanan ° C önceden enjeksiyonları bir konsantrasyona seyreltilir.
- RNA kodlama fonksiyonel Tol2 transposase enzim pDB600 plasmid2 in vitro transkripsiyonu. Biz Qiagen Midi-Prep kiti kullanılarak plazmid arındırmak, daha sonra 10-20 mg XbaI linearize. MRNA sentezini mMESSAGE mMACHINE Kiti protokolü (Ambion) yürütülmektedir.
- Biz arındırmak ve kiti talimatlarına göre RNA hızlandırabilir. Biz RNaz ücretsiz su ~ 1μg/μl nihai bir konsantrasyon, ya da tek bir reaksiyon için 20 ul RNA tekrar süspansiyon ve UV spektrofotometresi ile ölçmek. Ayrıca, tam uzunlukta transkripsiyon doğrulamak için agaroz jel elektroforezi ile RNA ~ 1μg analiz. Bu analiz için standart TAE veya TBE jel yeterli olmasına rağmen, transkripsiyon kiti ile denatüre örnek tampon kiti talimatlarına göre kullanılmalıdır.
- Biz, bilinen bir plazmid (Şekil 1) enjeksiyonları yaparak etkinlik için, transposase RNA her yeni toplu test edin. Denetlemeden sonra, RNA küçük alikotları içine bölünmüş ve -80 saklanan ° C, tekrarlanan çözülme ve bireysel alikotları, tekrar soğutulmasından kaçınmak için.
Şekil 1. Zebra balığı embriyo fare Sox10 arttırıcı ile kontrol (Üst) aydınlık (Alt) GFP floresan görüntü olarak enjekte edildi. Transposase RNA Her yeni toplu etkinlik için test edilir.
2. Mozaik transgenik analizi için zebrafish embriyoların Mikroenjeksiyon
- Biz sağlam chorions nüfuz oldukça keskin konik güçlü bir ipucu verim için tasarlanmış bir program ile, 1.2 mm OD filament kılcal cam bir Sutter P-97 Mikropipet Çektirme mikroenjeksiyon için iğne çekin. Biz temiz bir jilet ve bir mikrometre slayt kullanarak, dış çapı yaklaşık 15 mikron stereomikroskop altında elle ipuçları bölünürler. Iğneler gün enjeksiyonlar önce yapılmış ve temiz tutmak için kapalı bir elinde tabak içinde saklanan olabilir.
- Biz, 14 saat ışık altında standart conditions3, düzenli bir ışık karanlık döngüsünde zebrafish koruyacağız. Gün önce performans microinjections, biz küçük bir yetiştirme tankları, bir temel tank oluşan her bir oluklu eklemek ve plastik bir kapak zamanlanmış çiftleşmelerin balık kurdu. Biz üç kadın veya iki erkek t her yerdeparalel sıralar halinde Ank.
- Microinjections sabahı, ışık döngüsü başlar kısa bir süre sonra, erkek ve kadınlarda yumurta üretimi için temiz bir sistem arıtılmış su birleştirerek başlar. Balık sık sık kontrol edin ve birkaç dakika içinde döşeme yumurta toplamak iyi senkronize toplu almak için önemlidir. Yumurta üretimi, sabah boyunca taze balık grupları birleştirmek için devam ederek, 2-3 saat boyunca muhafaza edilebilir.
- Geniş bir delikli, 5 1 / 4 "cam Pasteur pipeti bir lateks ampul ile donatılmış, kısmen Embriyo Medium2 dolu 50 embriyoların gruplar halinde 60 x 15 mm Petri kapları, toplanan embriyolar sıralamak ve işaretlemek zaman toplanan Her çanak kapağı.
- Balık döşeme bir kez başladıktan sonra, biz, buz üzerinde bir mikrofuge'de tüp içinde aşağıdaki karıştırılarak taze enjeksiyon çözelti hazırlamak:
Bileşen Transposon plazmid stok (125ng/μl) 1μl Transposase RNA stok (175ng/μl) 1μl Fenol kırmızı stok (H 2 O 2%) 0.5μl RNaz ücretsiz su 2.5μl
Enjeksiyon iğneleri, yemekler tutarak koydu ve geniş ucuna her iğne enjeksiyon solüsyonu 500 nl damla pipetleme tarafından doldurulacaktır. Ucu kapiller eylem yoluyla sıvı çekilir sonra, ek çözüm 1.5-2 ul toplam eklenebilir. Biz her enjeksiyon çözümü için en az iki iğne hazırlar. - Dolu iğne yapılandırılmış ve üreticinin talimatlarına göre N2 tankına bağlı bir Pnömatik Pico-Pompa veya benzeri basıncı enjektör, iğne tutucu düzenlenen el yüklenir. Biz bir mikrometre slayt, mineral yağ atılır damlacıkları çapını ölçerek enjeksiyon hacimleri kalibre edin. Tipik olarak, 20 psi basınç ile 120 ms bir enjeksiyon süresi yaklaşık 1 nl bir damlacık verecektir, ancak iğne çapı küçük farklılıklar bu parametreleri etkileyecek ve kalibrasyonu iğneler arasında gerekli olabilir.
- Enjeksiyonları, 6-10X büyütme stereomicroscope altında yapılmaktadır. Biz ince forseps embriyo yerde tutun koryon ve bir hücre veya iki hücre erken aşamada bir embriyo sarısı içine sabit bir basınç ile enjeksiyon iğnesi itmek için bir çift kullanın. İdeal olarak, biz sadece blastomer altında sarısı iğne ucu yerleştirin. Enjeksiyon solüsyonu yaklaşık 1 nl kovdu ve iğne geri çekilir. Her biz ≥ 200 embriyolar enjekte oluşturmak için. Uninjected kontrol embriyoların bir çanak kaydetmek için, toplanan embriyoların her kavrama de çok önemlidir.
- Enjeksiyonları tamamlanmıştır sonra, döllenmemiş yumurta, hasarlı embriyolar ve başarısız enjeksiyonları (blastomerlere hiçbir fenol kırmızısı embriyo) kaldırarak embriyoların sıralayabilirsiniz. Daha sonra için 28.5 ° C uygun zaman kadar gözlemler embriyolar embriyo ortamda kuluçkaya yatmaktadır.
3. Mozaik ekspresyonu analizi
- Uygun bir kuluçka süresini takiben, floresan enjekte edilen embriyolar inceleyin. Zamanlama endojen zebrafish genin normal ifade desenini bağlıdır, ancak genellikle ilk 5 gün gübreleme yoluyla günlük bak.
- Biz Epifloresans için takılan bir Olympus MVX10 Makroskop'ta floresan embriyoların incelemek, ancak herhangi bir benzer bir mikroskop çalışma düşük güç görüntüleme yeteneğine sahip olacak. Ölen ya da ilk gün anormal şekilde gelişmiş çok sayıda embriyo varsa, normal bakarsanız bakın bu kavrama uninjected kontrolleri bakmak. Kontrolleri normal bakarsanız, en sık karşılaşılan sorun, enjekte edilen DNA yetersiz saflık. Ayrıca, embriyoların erken dönemde toplam tutarı enjekte plazmid duyarlı, bu yüzden miktarının yanlış olduğunu ve çok fazla DNA enjekte olduğunu mümkündür.
- Embriyolar incelerken, hepsi enjekte inşa mozaik olacağını aklınızdan çıkarmayın. Bu ifade beklenen etki alanı küçük, özellikle de tüm embriyoların dikkatli bakmak gerekli olacaktır. Ayrıca ifade dinamik olabileceğini unutmayın; güçlü floresan gün 1 gün 2, ve ifade etmek için ilk 3 gün günde 4 şey gösterebilir negatif embriyolar kaybolabilir.
- Biz daha geniş bir ifade ile bazı embriyolar seçin ve photomicroscopy floresan desen belge bu. Gözlemlerin 5 gün sonra, embriyoların tesisine iade edilmelidir ve bir hisse senedi olarak gündeme. Birkaç ay içerisinde, yetişkinler transgenlerin germline iletimi için taranmalıdır.
4. Sonuçlar
Biz geniş bir v bakınbağlı olarak analiz edilen artırıcı unsuru desen ve ifade düzeyleri ariety. Biz genellikle çok doku spesifik ekspresyonu ilgilendi ve genellikle iskelet ifade genler üzerinde duruluyor. ve genellikle iskelet genlerin üzerinde duruluyor. Şekil 2, kıkırdak ve kemik ifade düzenleyen arttırıcılar ile enjekte edilen embriyolar gözlenen mozaik ekspresyonu örnekleri gösterir. Son olarak, test dizilerinin önemli bir kısmının doku spesifik ifade düzenleyen yok. Bunlar için, çoğu kez çok az floresan, embriyo başına belki birkaç dağınık hücreleri bakın. Daha az sıklıkta, ama sadece iki ortak siteleri ektopik ifade, epidermis ve iskelet kası (Şekil 3), floresan görebilirsiniz. 
Şekil 2. Enjekte edilen embriyolar gözlenen kıkırdak ve kemik ekspresyonu örneği. 
Şekil 3. Gen ve ifade düzenlenmesi arttırıcı göreli konumu arasında çok az bir korelasyon vardır. Test dizilerinin önemli bir bölümü, doku spesifik ifade düzenleyen yok . Bunlar genellikle çok az floresan veya ektopik ifade için iki ortak olabilir: epidermis ve iskelet kası. (Üst) aydınlık görüntü (Alt) GFP floresan görüntü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz potansiyel arttırıcılar zebrafish transgenesis kullanarak etkin bir şekilde analiz için laboratuarda kullanılan yaklaşım göstermiştir. Çoğu zaman, biz insan genleri ile ilişkili doku-spesifik arttırıcılar bakmak için bu yaklaşımı kullanmak. Bariz dizi homoloji olmamasına rağmen çoğu zaman insan ve balık olmayan kodlama dizileri, bu yaklaşım bize ilgi genler için arttırıcılar belirlenmesinde genellikle başarılı olduğunu bulmak. Arasındaki Başarı için kritik faktörler, plazmid DNA ve RNA transposase hazırlanmasında özen ve enjekte etme ve her bir yapı için yeterli sayıda embriyo incelenmesi. Transgen inşaat, embriyo microinjections, ve mozaik ifade analizi genel yöntemler, birçok başka amaçlar için transgenik zebrafish hatları üreten için geçerli olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Mükemmel balık yetiştiriciliği için Bayan Paula Roy ve Steve Ekker pDB600 plazmid tür hediye için teşekkür ederim. Bu çalışmalar NHGRI SF bir hibe ile finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | |
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | |
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | |
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- The Zebrafish Book. Westerfield, M. , 3 ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (1995).
