Summary
호중구 세포 트랩 (그물) 병원성 박테리아, 곰팡이 및 기생충에 대항하는 중요한 타고난 면역 메커니즘입니다. 여기 우리는 인간의 피를에서 호중구 granulocytes을 분리하고 그물을 형성 그들을 활성화하는 방법을 설명합니다. 우리는 빛과 전자 현미경의 그물을 시각화하기 위해 준비 기술을 제시한다.
Abstract
호중구의 granulocytes는 주변 혈액에 leukocytes의 가장 풍부한 그룹입니다. 전문 phagocytes, 그들은 아마 박테리아와 intracellularly 그들을 죽일 phagosome 그들의 항균 과립 퓨즈. 우리는 neutrophils는 미생물을 죽이는의 추가 방법을 발견 : 활성화시, 그들은 함께 세포 섬유를 형성 과립 단백질과 염색질을 공개 바인딩 병원균 것을. 이 소설의 구조, 또는 호중구 세포 트랩 (그물), 독성 요인을 저하 및 세균 1, 곰팡이 기생충 2 3 죽여. 네츠의 구조적 근간은 DNA이며, 그들은 DNases의 존재에 신속하게 저하됩니다. 따라서, DNases을 표현하는 박테리아는 4 더 악성입니다. TEM, SEM, immunofluorescence 및 라이브 셀 이미징 기술을 결합하여 상호 현미경을 사용하여, 우리는 자극에 따라, neutrophils의 핵은 그 모양을 잃게하고 EU와 heterochromatin이 균질 것을 알 수 있습니다. 나중에 핵 봉투 및 과립 점막은 NET 구성 요소의 혼합을 허용 분해. 마지막으로, 그물은 세포막 나누기로 발표하고 있습니다. 이 세포 죽음 프로그램 (NETosis)은 apoptosis와 괴사와는이며 NADPH 산화 효소 5 반응 산소 종의 생성에 따라 달라집니다.
호중구 세포 트랩은 급성 염증의 사이트에서 풍부한 있습니다. 네츠는 바인드 미생물 즉, 확산을 방지하고, 독성 요인을 저하하고 neutrophils도 자신의 수명이 넘어 자신의 항균 기능을 수행 수 있도록함으로써 병원체를 죽이는 항균 대리인의 높은 지방 농도를 보장 타고난 면역 반응의 한 형태로 나타납니다. 증거가 증가하고있다, 그러나, 그 그물은 또한 질병에 관련된 면역 syndromes에서 불임 6 다양합니다.
우리는 주변 사람의 혈액 7 호중구 Granulocytes을 분리하고 그물을 형성하도록 자극하는 방법을 설명합니다. 또한 우리는 빛과 전자 현미경의 그물을 시각화하는 프로토콜이 포함됩니다.
Protocol
1. 인간의 혈액에서 PMN 격리
항응고제로 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 또는 헤파린 (10 U / ML) 24 ML 인간의 혈액에 대해 사용합니다.
- 15 ML 팔콘 튜브 6 ML Histopaque 1119를 추가하고 위에 조심스럽게 레이어 5-7 ML 전체 혈액.
- 제동없이 800 XG에서 20 분 동안 원심 분리기.
- 기음과 폐기 노란 맑은 상위 레이어를 신선한 팰컨 튜브에 granulocytes를 포함하는 낮은 붉은 단계를 전송합니다.
- 300 x G. 10 분 PBS 및 원심 분리기와 팔콘 튜브를 작성하여 세포를 씻어
- 한편 2 ML 10X PBS 18 ML Percoll를 혼합하여 100 % Percoll 솔루션을 준비합니다. 1X PBS 85 %, 80 %, 75 %, 70 % 및 65 % Percoll 4 ML 솔루션을 준비와 함께.
- 주문을 감소 서로의 위에 모든 비율이 겹겹이 ML하여 Percoll 기울기 2 팰컨 튜브를 준비합니다.
- 원심 분리가 뜨는을 제거한 후, PBS 4 ML에 쥐똥과 resuspend sedimented 세포를 결합.
- 그라디언트의 각 방향 resuspension의 신중 레이어 2 ML.
- 제동없이 800 XG에서 20 분 동안 원심 분리기.
- 원심 분리 최고 레이어를 제거하고 65% 계층의 대부분 PBMCs와 85 % 계층까지 새로운 팔콘 튜브에 흰색 나머지 타령을 수집 후.
- 300 x G. 10 분 PBS와 원심 분리기와 팔콘 튜브를 작성하여 세포를 씻어
- PBS의 2ml에 뜨는 및 resuspend sedimented 세포를 (보통> 95 % PMN 아르)를 제거합니다.
- hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다.
2. 활성화 PMNs
- 각 우물에 살균 13mm 원형 유리 커버 슬립 (# 1.5)를 넣어 24 웰 세포 배양 판을 준비
- 씨앗이 500μl RPMI에서 X 10 5 세포를 잘 당 (2 % 인간 혈청 알부민을 포함)과 37 CO 2 배양기에서 1 시간을위한 품어 ° C.
- 한편 RPMI에서 600 NM PMA 솔루션을 준비하고 100μl 잘 따라 세포에 추가할 수 있습니다. 37까지 CO 2 배양기에서 4 H 15 분부터 품어 ° C.
- 4퍼센트 (최종 농도) PBS에 용해 paraformaldehyde에서 세포를 수정.
PMA는 긍정적인 제어 역할을하고 지금까지 NET 형성을 유도하는 가장 강력한 대리인이다. 또한, 병원균과 다른 자극 또는 공동 재배는 NET 유도 사용할 수 있습니다.
시간 코스 진행되는 동안 추가 병렬 샘플 준비하는 경우 NET 형성의 각 상태는 확인하실 수 있습니다. Sytox 그린 (Invitrogen)과 같은 비 permeant DNA의 염료가 아닌 고정 셀을 추가하는 경우에만 세포 DNA가 감지됩니다. 새로운 그물 형성이 어떻게든 때마다 포인트, Sytox의 면전에서 장애인이기 때문에 한 병렬 샘플은 사용할 수 있습니다.
3. immunolabeling에 의해 NET 검출
그물도 고정 후 매우 연약하고, 아주 조심스럽게 조작으로 달리 대부분이 준비 중 길을 잃기 쉬우니있다.
- 신중하게 굽은 바늘로 가장자리에 그것을 리프팅하여 24 잘 문화 플레이트의 부착 세포와 유리 커버 전표를 제거하고 훌륭한 포셉로 점유. PBS의 드롭에 거꾸로 커버 슬립을 넣어. 이 테스트 튜브 스탠드를 덮고 Parafilm 시트에서 할 수 있습니다. 5 분이 3 번 같은 씻으십시오.
- 트리톤은 X - 100 RT 1 분 세포를 permeabilize하기 위해 0.5 %의 드롭 같은 방식으로 커버 전표를 품어. 1 분을위한 PBS로 3 번 씻으십시오.
- Parafilm와 젖은 휴지로 습기 챔버를 준비합니다. 덮개가 차단 버퍼 (5 % 당나귀 혈청)의 드롭 거꾸로 미끄러져 누워 37 30 분 품어 ° C.
- 버퍼를 차단의 기본 항체, 예를 들어 MS 안티 히스톤 및 RB 안티 호중구 엘라스타제을 희석.
- 기본 항체의 드롭에 버퍼를 차단에서 직접 습기 챔버에서 전표를 커버 37 1 H에 대한 품어 전송 ° C.
- PBS로 5 분 3 번 씻으십시오.
- 이차 항체, 예를 들어 DK 안티 MS Cy2와 버퍼를 차단에 DK 방지 RB Cy3를 희석.
- 이차 항체의 드롭에 습기 챔버에 전표를 커버 37 1 H에 대한 품어 전송 ° C.
- PBS로 5 분 3 번 씻으십시오. 얼룩 DNA는 UV 여기거나 멀리 붉은 여기에 대한 Draq5로 필요하고 디스트로 두 번 씻어 것입니다 Hoechst 33342 (1 μg / ML)와 중 5 분 들어, 형광 현미경 옵션에 따라 다릅니다. 물.
- 유리 슬라이드에 Mowiol의 20μl 방울을 설정하고 거꾸로 전지 커버 전표를 탑재합니다. 세포는 커버 슬립 및 슬라이드 사이에 있어야합니다. Mowiol의 드롭 커버 슬립이 드롭 위치는 균일한 두께의 얇은 레이어를 형성합니다. 일반적으로 샘플을 눌러 필요가 없습니다. 가 아닌 침지 렌즈를 사용하려는 경우, 표본은 조사를 위해 준비가 된 것입니다.침지 렌즈와 현미경의 분석을 위해, Mowiol이 샘플의 가장자리 경화까지 약 1 시간에 대한 표본은 건조하게.
4. 전자 현미경을 검사에 대비하여 그물 (SEM)
- 2,5 %의 글루 타 알데히드 24 - 잘 판에있는 유리 커버 전표에서 세포를 수정 게시합니다.
- 24 잘 문화 판의 세포를 포함하는 유리 커버 전표를 제거하고 물 한 방울에 거꾸로 내려놔. 5 분이 3 번 같은 씻으십시오.
- 30 분 0,5 % OsO4과 부화를 포함한 24 웰 세포 배양 플레이트에 다시 커버 전표를 전송합니다.
- 24 잘 문화 판의 세포를 포함하는 유리 커버 전표를 제거하고 물 한 방울에 거꾸로 내려놔. 5 분이 3 번 같은 씻으십시오.
- 30 분 1퍼센트 타닌산과 부화를 포함한 24 웰 세포 배양 플레이트에 다시 커버 전표를 전송합니다.
- 단계를 반복 4.2-4.4
- 다음과 같은 처방 (5 분 각각)를 통해 탈수 :
- 30 % 에탄올
- 50 % 에탄올
- 70 % 에탄올
- 80 % 에탄올
- 90 % 에탄올
- 100 % 에탄올
- 100 % 에탄올
- 100 % 에탄올
- 임계점 건조기 건조 표본으로 전표를 커버 전송합니다.
- 얇은 레이어 증발기를 사용하여 5nm 플라틴 / 탄소 층과 표본의 코트 표면
5. 대표 결과 :
절연 방식은 일반적으로 95%보다 순도와 unstimulated 가능한 neutrophils를 산출. 자극 후 다른 시간 시점에서 고정되면, immunostaining 프로토콜 NETosis의 평평화 세포, 핵 lobules의 손실, 과립의 손실과 핵 (히스톤 IE)와 세분화된 (즉,의 증가 오버랩로 연결 핵 무결성 중 형태학의 변경 순서를 보여줍니다 호중구 엘라스타제) 염색법. 이 프로토콜은 neutrophils과 병원균의 특정 상호 작용을 분석하는 출발점이 될 수 있습니다. 이 상호 작용은 전자 현미경을 스캐닝을위한 준비 프로토콜을 사용하여보다 자세한 해부를하실 수 있습니다.
NET 형광
NET 구성 요소 (청색 = DNA, 빨강 = 히스톤, 녹색 = 호중구 엘라스타제)의 스테인드 자극 neutrophils의 샘플. 이미지 NET 현지화, DNA와 histones의 핵 지방화 및 호중구 엘라스타제에 대한 세분화된 패턴 외에도 보여줍니다.
SEM PMA의 자극
비 자극 및 PMA 자극 neutrophils을 보여주는 전자 현미경을 검사합니다. 자극 후, neutrophils 밖으로 평평하게하고 그물을 생산합니다.
SEM 그물과 시겔라
그물에 갇힌 시겔라 세균의 높은 해상도의 SEM 이미지.
Discussion
제공된 프로토콜은 상당한 순도에 비 자극 neutrophils의 고립, NET 형성의 유도와 NETosis 중 형태학의 변화의 분석을하실 수 있습니다. 주의 표본을 처리하는 경우, 즉 느슨하게 연결된 그물의 대부분의 손실됩니다 거친 세척 조건을 피하기 위해, 다양한 자극 조건 형성 NET (기간, 자극)의 양은 비교할 수 있습니다. 호중구 / 병원체 상호 작용, 자극의 순서, 다른 면역 세포와 상호 작용 :이 존중에서 제공하는 프로토콜은보다 정교한 시나리오를 분석하는 방법을 확립하기위한 출발점이 될 수 있습니다.
References
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