Summary
中性粒细胞（以英语为母语的英语教师）外的陷阱是一个重要的先天免疫机制，对抗致病的细菌，真菌和寄生虫。在这里，我们描述的方法来隔离从人体血液中的中性粒细胞粒细胞和激活它们形成以英语为母语的英语教师。我们目前的制备技术，以可视化在光学显微镜和电子显微镜的以英语为母语的英语教师。
Abstract
嗜中性粒细胞粒细胞是最丰富的组的外周血白细胞。作为专业的吞噬细胞，吞噬细菌和细胞内杀死他们时，他们的抗菌颗粒吞噬的导火索。我们发现，嗜中性粒细胞杀死微生物的其他方式：激活后，他们释放颗粒蛋白和染色质，共同形成了外纤维结合的病原体。这些新颖的结构，或中性粒细胞（以英语为母语的英语教师）外的陷阱，降低致病因素， 并杀死1细菌，真菌和寄生虫3。结构以英语为母语的英语教师骨干的DNA，他们正在迅速退化DNases存在。因此，表达DNases的细菌毒性更强的 4 。使用相关显微镜，透射电子显微镜，扫描电镜，免疫荧光法和活细胞成像技术相结合，我们可以显示，刺激后，中性粒细胞的细胞核失去它们的形状和欧盟和异均质。后来，核膜和颗粒膜的瓦解使NET组件的混合。最后，以英语为母语的英语教师被释放细胞膜断裂。这种细胞死亡程序（NETosis）是有别于凋亡和坏死，取决于生成活性氧，NADPH氧化酶 5 。
在急性炎症的网站丰富的中性粒细胞外的陷阱。以英语为母语的英语教师似乎是先天免疫反应的一种形式，结合微生物，防止火势蔓延，并保证了很高的抗菌药物的局部浓度，降低致病因素，从而使中性粒细胞，以履行其抗菌功能，甚至超越了他们的寿命杀灭病原体。然而，越来越多的证据，以英语为母语的英语教师也参与疾病，自身免疫综合征不孕6。
我们描述的方法来隔离外围人体血液中7的嗜中性粒细胞，并刺激他们形成以英语为母语的英语教师。同时，我们也包括协议，在光学和电子显微镜可视化的以英语为母语的英语教师。
Protocol
1。从人体血液中的中性粒细胞的分离
使用约24毫升EDTA或肝素（10 U / ml）的人体血液抗凝。
- 加入6毫升Histopaque 1119至15毫升猎鹰管和认真层之上的5至7毫升全血。
- 离心20分钟800 XG没有刹车。
- 吸丢弃黄色的和明确的顶层和转移较低偏红相食入猎鹰管粒。
- 用PBS离心10分钟，在300 × G.填补猎鹰管清洗细胞
- 在此期间，准备用2 ml 10X PBS混合18毫升Percoll的一个100％的Percoll解决方案。随着1X PBS准备了4毫升的85％，80％，75％，70％和65％Percoll解决方案。
- 准备用Percoll梯度分层2毫升每百分比递减的顺序彼此顶部2猎鹰管。
- 离心后除去上清液，结合4毫升的PBS颗粒和悬浮沉淀细胞。
- 仔细层2毫升的再悬浮到每个梯度。
- 离心20分钟800 XG没有刹车。
- 离心后除去顶层和大部分的65％，层与外周血单个核细胞，直到85％层收集到新的猎鹰管白色其余interphases。
- 填补了10分钟，用PBS离心300 × G.猎鹰管清洗细胞
- 删除2毫升的PBS上清和悬浮沉淀细胞（通常> 95％，中性粒细胞）。
- 使用血球计数细胞。
2。激活中性粒细胞
- 准备一个24孔细胞培养板，每口井投入无菌的13毫米的圆形玻璃盖玻片（＃1,5）
- 种子2 × 10 5细胞500μL的RPMI（含2％的人血清白蛋白）每口井的CO 2培养箱1H在37 ° C.
- 同时准备600纳米的RPMI PMA的解决方案，并添加到100μL，每孔细胞。从15分钟可达4 h中的CO 2培养箱孵育37 ° C。
- 在4％（最终浓度）的PBS溶解多聚甲醛固定细胞。
物业管理公司作为阳性对照，是迄今为止最有力的代理人诱导NET形成。另外，其他病原体的刺激或共同培育可用于NET的感应。
NET中形成的各自的地位，可以检查的时间当然是进行时，如果额外的平行样品准备。如果像Sytox绿色（Invitrogen）的非permeant DNA染料被添加到非固定细胞，只有细胞外的DNA会被检测出来。由于形成新的以英语为母语的英语教师以某种方式损害Sytox存在，每个时间点，一个平行的样品已被使用。
3。 NET通过免疫标记检测
以英语为母语的英语教师是很脆弱的，即使固定后，非常小心，被操纵，否则多数人的意志得到失去了在准备。
- 小心地取出24孔培养板的贴壁细胞的玻璃盖玻片解除与弯针在边缘，并用细镊子抓住它。把盖玻片倒置的PBS下降。这是可以做到在封口膜覆盖试管架的板材。像这3次5分钟清洗。
- 在同样的方式在下降0.5％Triton X - 100的的在室温下1分钟通透细胞孵育盖玻片。 3倍的PBS洗1分钟。
- 准备与封口膜和湿纸巾的湿热试验箱。莱盖玻片倒置封闭液（5％驴血清）下降30分钟，在37 ° C。
- 主要抗体，如MS反华宏和Rb抗中性粒细胞弹性蛋白酶，在封闭液稀释。
- 传输覆盖在潮湿的室内单直接阻止缓冲区下降到初级抗体和孵育1 h后，于37 ° C。
- 5分钟，用PBS清洗3次。
- 淡化二次抗体，如DK反MS CY2和DK反RB Cy3标记，在封闭液。
- 传输覆盖到二级抗体下降到湿热试验箱单，孵育1 h后，于37 ° C。
- 5分钟，用PBS清洗3次。根据您的荧光显微镜，染色5分钟的DNA与赫斯特33342（1微克/毫升），这将需要紫外线激发或远红光激发Draq5洗两次与区。水。
- 设置Mowiol20μL下降到载玻片和安装与细胞盖玻片倒置。细胞之间的盖玻片和幻灯片。 Mowiol下降，会形成一层薄薄的同质盖玻片厚度时定位是下降。通常情况下，有没有需要按样品。如果你想使用非浸入式镜头，试样准备进行检查。浸泡镜片的微观分析，让试样干燥约1小时，直到Mowiol凝固在试样边缘。
4。准备以英语为母语的英语教师，扫描电子显微镜（SEM）
- 邮政修复用2.5％戊二醛在24孔板上的玻璃盖单细胞。
- 取出玻璃盖玻片含24孔培养板的细胞，并把一滴水倒挂。像这3次5分钟清洗。
- 含有0.5％OsO4孵育30分钟到24孔细胞培养板盖玻片转移。
- 取出玻璃盖玻片含24孔培养板的细胞，并把一滴水倒挂。像这3次5分钟清洗。
- 盖玻片转移到24孔细胞培养板，其中包含30分钟的1％鞣酸和孵化。
- 重复步骤4.2至4.4
- 脱水通过以下治疗方案（5分钟）：
- 30％的乙醇
- 50％的乙醇
- 70％的乙醇
- 80％的乙醇
- 90％的乙醇
- 100％的乙醇
- 100％的乙醇
- 100％的乙醇
- 传输覆盖到临界点干燥机和干燥样品的单。
- 涂层试样表面用一层薄薄的蒸发器与5nm的铂/碳层
5。代表性的成果：
隔离方法通常会产生未刺激可行的中性粒细胞纯度大于95％。当固定在不同时间点的刺激后，免疫协议显示NETosis细胞扁平，核小叶的损失，损失颗粒，细胞核完整，导致核（即组蛋白）和颗粒（即增加重叠期间的形态学变化序列中性粒细胞弹性蛋白酶）染色。这个协议可以作为一个出发点，以分析与中性粒细胞病原体的特异性相互作用。这种互动可以更用扫描电子显微镜的准备协议的详细解剖。
NET的荧光
NET组件（蓝色= DNA，红色=组蛋白，绿色=中性粒细胞弹性蛋白酶）染色的刺激中性粒细胞样本。图像显示，除了英语为母语的英语教师的定位，DNA和组蛋白的核本地化和中性粒细胞弹性蛋白酶颗粒格局。
教育统筹局局长PMA的刺激
扫描电子显微照片显示非刺激的中性粒细胞和PMA刺激。刺激后，中性粒细胞的扁平化，生产以英语为母语的英语教师。
扫描电镜英语教师和志贺氏菌
较高的分辨率的扫描电镜图像被困在以英语为母语的英语教师的痢疾杆菌。
Discussion
所提供的协议将允许非刺激中性粒细胞纯度相当孤立，NET中形成的诱导和NETosis过程中的形态学变化的分析。当小心处理的标本，即避免了苛刻的洗涤条件，这将导致损失的最松散连接的以英语为母语的英语教师，NET不同的刺激条件下形成的量（持续时间，刺激）可以比拟的。在这方面，所提供的协议可以作为出发点，以建立的方法来分析更复杂的场景：中性粒细胞/病原体相互作用，刺激序列，与其他免疫细胞的相互作用。
References
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