Summary
Las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) es un importante mecanismo de inmunidad innata para luchar contra las bacterias patógenas, hongos y parásitos. A continuación se describen los métodos para aislar a los granulocitos neutrófilos de la sangre humana y para activarlos para formar NET. Se presentan las técnicas de preparación para visualizar NET en la microscopía óptica y electrónica.
Abstract
Granulocitos neutrófilos son el grupo más abundante de los leucocitos en la sangre periférica. Como fagocitos profesionales, las bacterias hundir y matar a intracelularmente cuando el fusible de gránulos de antimicrobianos con el fagosoma. Hemos encontrado que los neutrófilos tienen una forma adicional de matar a los microorganismos: la activación, liberan proteínas granulares y de la cromatina que en conjunto forman las fibras extracelulares que se unen los patógenos. Estas nuevas estructuras, o las trampas de neutrófilos extracelular (TNE), la degradación de los factores de virulencia y matar las bacterias 1, 2 hongos y parásitos 3. La columna vertebral estructural de la TNE es el ADN, y se degrada rápidamente en la presencia de DNasas. Por lo tanto, las bacterias que expresan DNasas son más virulentas 4. Utilizando microscopía correlativa combinar TEM, SEM, las técnicas de inmunofluorescencia de células y en directo de imágenes, podemos demostrar que la estimulación, los núcleos de los neutrófilos pierden su forma y homogeneizar la UE y la heterocromatina. Más tarde, la envoltura nuclear y las membranas de gránulos se desintegran permitiendo la mezcla de componentes NET. Por último, las redes se lanzan como los saltos de la membrana celular. Este programa de muerte celular (NETosis) es distinta de la apoptosis y la necrosis y depende de la generación de especies reactivas del oxígeno por la NADPH oxidasa 5.
Neutrófilos trampas extracelulares son abundantes en los sitios de inflamación aguda. NET parece ser una forma de respuesta inmune innata que los microorganismos se unen, evitar que se propaguen, y asegurar una alta concentración local de agentes antimicrobianos para degradar los factores de virulencia y matar a los patógenos permitiendo así que los neutrófilos para cumplir con su función antimicrobiana incluso más allá de su vida. Cada vez hay más evidencia, sin embargo, que las redes también están implicados en enfermedades que van desde la auto-inmune síndromes de infertilidad 6.
Se describen los métodos para aislar a los granulocitos neutrófilos de 7 de sangre periférica humana y estimular a formar NET. También se incluyen los protocolos para visualizar las redes en microscopía óptica y electrónica.
Protocol
1. PMN aislamiento de la sangre humana
Utilice unos 24 ml de sangre humana con EDTA o heparina (10 U / ml) como anticoagulante.
- Agregar 6 ml Histopaque 1119 a un tubo Falcon de 15 ml y con mucho cuidado la capa de 5 a 7 ml de sangre entera en la parte superior.
- Centrifugar durante 20 minutos a 800 xg sin frenar.
- Aspirar y desechar la capa superior y amarillento claro y la transferencia de la fase inferior rojizo que contiene granulocitos en fresco tubos Falcon.
- Lavar las células llenando tubos Falcon con PBS y centrifugar durante 10 minutos a 300 x g.
- Mientras tanto preparar una solución de Percoll al 100% mediante la mezcla de 18 ml de Percoll con 2 ml de PBS 10x. Con 1x PBS preparar cuatro soluciones ml de 85%, 80%, 75%, 70% y 65% de Percoll.
- Preparar dos tubos Falcon con un gradiente de Percoll por capas de 2 ml de cada punto porcentual por encima de los demás en orden decreciente.
- Después de la centrifugación separar el sobrenadante, se combinan pellets y resuspender las células sedimentadas en 4 ml de PBS.
- Cuidado de la capa 2 ml de la resuspensión en cada uno de los gradientes.
- Centrifugar durante 20 minutos a 800 xg sin frenar.
- Después de la centrifugación quitar la capa superior y la mayoría de los 65% de la capa de PBMC y recoger blanco interfases restante hasta 85% en la capa de nuevos tubos Falcon.
- Lavar las células llenando los tubos Falcon con PBS y centrifugar durante 10 minutos a 300 x g.
- Eliminar las células sedimentadas sobrenadante y resuspender (normalmente> 95% PMN) en 2 ml de PBS.
- Recuento de células utilizando un hemocitómetro.
2. PMN activar
- Prepare una placa celular de 24 pocillos, poniendo una gasa estéril alrededor de 13 mm cubreobjetos de cristal (# 1,5) en cada pocillo
- Semillas de 2 x 10 5 células en 500μl RPMI (que contiene 2% de albúmina sérica humana) por pocillo y se incuba durante 1 hora en CO 2 incubadora a 37 ° C.
- Mientras tanto, preparar una solución de 600 nM PMA en RPMI y añadir a las células de 100μl por pocillo. Incubar de 15 min a 4 h de CO 2 incubadora a 37 ° C.
- Fijar las células en el 4% (concentración final) paraformaldehido disuelto en PBS.
PMA sirve como un control positivo y es hasta ahora el agente más potente para inducir la formación NET. Por otra parte, otros estímulos o co-cultivo con patógenos puede ser utilizado para la inducción de NET.
Los estatutos respectivos de la formación de NET se puede comprobar mientras que la evolución en el tiempo es lineal, en caso adicional de muestras paralelas están preparados. Si un medio de contraste de ADN no permeables como Sytox Verde (Invitrogen) se añade a las células no-fijo, sólo el ADN extracelular será detectado. Desde la creación de nuevas redes es de alguna manera altera en presencia de Sytox, para cada momento una muestra paralela tiene que ser utilizado.
3. NET detección por inmunomarcación
NET son muy frágiles, incluso después de la fijación y deben ser manipulados con mucho cuidado, de lo contrario la mayoría se pierden durante la preparación.
- Retire con cuidado el cristal de la cubierta se desliza con células adjunto de la placa de cultivo de 24 pocillos levantándolo en el borde con una aguja curva y tomar con una pinza fina. Coloque el cubreobjetos boca abajo sobre una gota de PBS. Esto se puede hacer en una hoja de Parafilm cubrir un puesto de tubo de ensayo. Lavado de la misma familia 3 veces por 5 min.
- Incubar cubreobjetos de la misma manera en una caída del 0,5% Triton X-100 durante 1 minuto a temperatura ambiente para permeabilizar las células. Lavar 3 veces en PBS durante 1 min.
- Preparar una cámara húmeda con Parafilm y un pañuelo de papel mojado. Ponga la tapa se desliza hacia abajo en una gota de tampón de bloqueo (5% burro suero) y se incuba durante 30 min a 37 ° C.
- Diluir anticuerpos primarios, por ejemplo, ms contra Histon y rb contra la elastasa de los neutrófilos, en tampón de bloqueo.
- La transferencia de la cubierta se desliza en la cámara húmeda directamente desde el amortiguador de bloqueo en una gota de anticuerpo primario y se incuba durante 1 hora a 37 ° C.
- Lavar 3 veces durante 5 minutos con PBS.
- Diluir secundaria de anticuerpos, por ejemplo, dk contra ms Cy2 y dk contra rb Cy3, en tampón de bloqueo.
- La transferencia de la cubierta se desliza en la cámara húmeda en una gota de anticuerpo secundario y se incuba durante 1 hora a 37 ° C.
- Lavar 3 veces durante 5 minutos con PBS. Dependiendo de las opciones de microscopía de fluorescencia, el ADN de la mancha durante 5 minutos, ya sea con Hoechst 33342 (1 mg / ml), que tendrá excitación UV o con Draq5 para la excitación del rojo lejano y lavar dos veces con dist. del agua.
- Establecer una gota de 20μl Mowiol en un portaobjetos de vidrio y montaje de la cubierta se desliza con células de al revés. Las células tienen que ser entre el cubreobjetos y la corredera. La caída de Mowiol se forma una fina capa de espesor homogéneo cuando la hoja de la cubierta se coloca en la caída. Normalmente, no hay necesidad de presionar la muestra. Si desea utilizar lentes de no-inmersión, la muestra está lista para inspección.Para el análisis microscópico con lentes de inmersión, que la muestra se seque durante 1 hora hasta que la Mowiol ha solidificado en el borde de la muestra.
4. NET para la preparación de Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
- Después de fijar las células en las hojas de cubierta de vidrio de 24 y placa con 2,5% de glutaraldehído.
- Eliminar hojas de vidrio cubierta con células de la placa de cultivo de 24 pocillos y poner boca abajo sobre una gota de agua. Lavado de la misma familia 3 veces por 5 min.
- La transferencia de la cubierta se desliza de nuevo en 24 y placa de cultivo celular que contiene 0,5% OsO4 e incubar durante 30 min.
- Eliminar hojas de vidrio cubierta con células de la placa de cultivo de 24 pocillos y poner boca abajo sobre una gota de agua. Lavado de la misma familia 3 veces por 5 min.
- La transferencia de la cubierta se desliza de nuevo en 24 y placa de cultivo celular que contiene 1% de ácido tánico y se incuba durante 30 min.
- Repita los pasos 4,2 hasta 4,4
- Deshidratan a través del siguiente régimen (5 minutos cada uno):
- 30% de etanol
- 50% de etanol
- 70% de etanol
- 80% de etanol
- 90% de etanol
- 100% de etanol
- 100% de etanol
- 100% de etanol
- La transferencia de la cubierta se desliza en secador de punto crítico y muestras secas.
- Capa superficial de la muestra con 5 nm platino / carbón de capa con evaporador de capa fina
5. Los resultados representativos:
El método de aislamiento por lo general los rendimientos de los neutrófilos no estimulados viable con una pureza superior al 95%. Cuando se fija en diferentes puntos de tiempo después de la estimulación, el protocolo de inmunomarcación muestra la secuencia de cambios morfológicos en células NETosis aplanamiento, la pérdida de los lóbulos nucleares, la pérdida de gránulo y la integridad del núcleo que conduce a una creciente superposición de las armas nucleares (es decir, las histonas) y granular (es decir, elastasa de los neutrófilos) tinción. Este protocolo puede servir como punto de partida para analizar las interacciones específicas de los agentes patógenos con los neutrófilos. Esta interacción puede ser diseccionado con más detalle utilizando el protocolo de preparación para microscopía electrónica de barrido.
NET de fluorescencia
Muestra de neutrófilos estimulados teñidos para NET (azul = ADN, rojo = histonas, verde = elastasa de los neutrófilos). Las imágenes muestran, además de la localización NET, la localización nuclear de ADN y las histonas y el patrón granular para la elastasa de los neutrófilos.
SEM PMA estimulación
Micrografía electrónica de barrido que muestra no neutrófilos estimulados y PMA estimulada. Después de la estimulación, los neutrófilos se aplanan y producir NET.
SEM NET y Shigella
Mayor resolución de imagen SEM de la bacteria Shigella atrapados en las redes.
Discussion
El protocolo deberá permitir que el aislamiento de los neutrófilos no estimulados con una pureza considerable, la inducción de la formación de NET y el análisis de los cambios morfológicos durante NETosis. Cuando se manipulan las muestras con cuidado, es decir, evitar las duras condiciones de lavado que se traducirá en la pérdida de la mayoría de las redes unen libremente, la cantidad de formación de NET en condiciones diferentes de estimulación (duración, estímulo) se pueden comparar. En este sentido, los protocolos que pueden servir como punto de partida para establecer los métodos para analizar los escenarios más sofisticados: las interacciones de neutrófilos / patógeno, la secuencia de estímulos, la interacción con otras células inmunes.
References
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