Summary
Neutrofila Extracellulär Fällor (NET) är en viktig medfödda immunförsvaret mekanism för att bekämpa sjukdomsframkallande bakterier, svampar och parasiter. Här beskriver vi metoder för att isolera neutrofila granulocyter från humanblod och att aktivera dem att bilda NET. Vi presenterar beredningen tekniker för att visualisera NET inom ljus-och elektronmikroskopi.
Abstract
Neutrofila granulocyter är den vanligaste gruppen av leukocyter i perifert blod. Som professionella fagocyter, de uppsluka bakterier och döda dem intracellulärt när deras antimikrobiella granulat säkring med phagosome. Vi fann att neutrofiler har ytterligare ett sätt att döda mikroorganismer: Vid aktivering, de släpper granulat proteiner och kromatin som tillsammans bildar extracellulära fibrer som binder patogener. Dessa nya strukturer, eller neutrofila Extracellulär fällor (NET), försämra virulensfaktorer och döda bakterier 1, svampar 2 och parasiter 3. Den strukturella ryggrad av nät är DNA, och de är snabbt bryts ned i närvaro av DNases. Således bakterier uttrycka DNases är mer virulent 4. Använda korrelat mikroskopi kombinera TEM, SEM, immunofluorescens och levande cell imaging tekniker, kunde vi visa att vid stimulering, kärnan av neutrofiler förlorar sin form och EU-och heterochromatin homogenisera. Senare kärnhöljet och membran granulat upplösas låta blandningen av NET-komponenter. Slutligen är det nät utsläppt som bryter cellmembranet. Denna celldöd programmet (NETosis) skiljer sig från apoptos och nekros och beror på generering av reaktiva syreradikaler av NADPH-oxidas 5.
Neutrofila extracellulära fällor är riklig i områden av akut inflammation. NET verkar vara en form av medfödda immunförsvaret som binder mikroorganismer, förhindra dem från att sprida sig, och garantera en hög lokal koncentration av antimikrobiella medel att förnedra virulensfaktorer och döda patogener vilket gör att neutrofiler att fullgöra sina antimikrobiella fungera även utanför deras livslängd. Det finns ökande bevis, dock att NET också involverade i sjukdomar som sträcker sig från autoimmuna syndrom till infertilitet 6.
Vi beskriver metoder för att isolera neutrofila granulocyter från perifert blod 7 och stimulera dem att bilda NET. Också vi inkluderar protokoll för att visualisera NET inom ljus-och elektronmikroskopi.
Protocol
1. PMN Isolering av humant blod
Använd ca 24 ml blod med EDTA eller heparin (10 E / ml) som antikoagulant.
- Tillsätt 6 ml Histopaque 1119 till 15 ml Falcon rör och noga nivå-5-7 ml helblod ovanpå.
- Centrifugera i 20 minuter vid 800 xgi utan att bromsa.
- Aspirera och kassera gulaktig och klar översta lagret och överföra lägre rödaktig fasen innehåller granulocyter till frisk Falcon rör.
- Tvätta cellerna genom att fylla upp Falcon rör med PBS och centrifugera i 10 minuter vid 300 x g.
- Under tiden förbereder en 100% Percoll lösning genom att blanda 18 ml Percoll med 2 ml 10x PBS. Med 1x PBS förbereda 4 ml lösning med 85%, 80%, 75%, 70% och 65% Percoll.
- Förbered 2 Falcon rör med en Percoll lutning genom att skikta 2 ml av varje procentenhet ovanpå varandra i fallande ordning.
- Efter centrifugering avlägsna supernatanten, kombinera pellets och återsuspendera sedimenterade celler i 4 ml PBS.
- Försiktigt lager 2 ml av resuspension mot varje gradienter.
- Centrifugera i 20 minuter vid 800 xgi utan att bromsa.
- Efter centrifugering bort översta lagret och de flesta av de 65%-skikt med PBMC och samla vitt återstående interphases tills 85%-lager till nya Falcon rör.
- Tvätta cellerna genom att fylla upp Falcon rör med PBS och centrifugera i 10 minuter vid 300 x g.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera sedimenterade celler (vanligtvis> 95% är PMN) i 2 ml PBS.
- Räkna celler med en hemocytometer.
2. Aktivera PMNs
- Förbered en 24-brunnar cellodling genom att sätta en steril 13 mm rund slip skyddsglaset (# 1,5) i varje brunn
- Seed 2 x 10 5 celler i 500μl RPMI (innehållande 2% humant serumalbumin) per brunn och inkubera i 1 timme i CO 2 inkubator vid 37 ° C.
- Under tiden förbereder en 600 nm PMA lösning i RPMI och lägga till celler 100μl per brunn. Inkubera från 15 min upp till 4 timmar i CO 2 inkubator vid 37 ° C.
- Fix celler i 4% (slutet av koncentration) paraformaldehyd upplöst i PBS.
PMA fungerar som en positiv kontroll och är hittills den mest potenta läkemedel för att framkalla NET bildas. Alternativt kan andra stimuli eller co-odling med patogener användas för NET induktion.
Respektive status NET bildning kan kontrolleras medan tid kursen framskrider, om ytterligare parallella provföremålen. Om en icke-permeant DNA färgämne som Sytox Green (Invitrogen) läggs till den kvarvarande celler, kommer bara extracellulärt DNA detekteras. Sedan bildandet av nya nät på något sätt försämras i närvaro av Sytox för varje tidpunkt ett parallellt prov måste användas.
3. NET upptäckt av immunolabeling
NET är mycket bräcklig även efter fixering och måste hanteras med stor försiktighet, annars majoriteten kommer att gå vilse under förberedelserna.
- Ta försiktigt bort glider glaskupa med bifogade celler från 24-och kultur plattan genom att lyfta upp det i kanten med en böjd nål och ta den med en fin pincett. Sätt på locket glida upp och ner på en droppe PBS. Detta kan göras på ett Parafilm ark som täcker en monter provrör. Tvätta gillar det här 3 gånger i 5 min.
- Inkubera täckglas på samma sätt i en droppe 0,5% Triton X-100 i 1 min vid RT till permeabilize celler. Tvätta tre gånger i PBS i 1 min.
- Förbered en fuktkammare med Parafilm och en våt vävnad. Lägg locket glider upp och ner på en droppe blockerande buffert (5% åsna serum) och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
- Späd primära antikroppar, t.ex. ms mot Histon och RB anti neutrofila Elastase, i blockerande buffert.
- Överföring täckglas i fuktig kammare direkt från blockerande buffert på en droppe av primär antikropp och inkubera i 1 timme vid 37 ° C.
- Tvätta tre gånger under 5 minuter med PBS.
- Späd sekundära antikroppar, t.ex. DK anti ms Cy2 och DK anti RB Cy3, i blockerande buffert.
- Överför täckglas i fuktig kammare på en droppe av sekundär antikropp och inkubera i 1 timme vid 37 ° C.
- Tvätta tre gånger under 5 minuter med PBS. Beroende på din fluorescensmikroskopi alternativ, i 5 min fläcken DNA antingen med Hoechst 33.342 (1 mikrogram / ml) som behöver UV-excitation eller med Draq5 för långt rött excitation och tvätta två gånger med dist. vatten.
- Ställ en 20μl droppe Mowiol på en glasskiva och montera täckglas med celler upp och ner. Cellerna måste vara mellan täckglas och bilden. Den droppe Mowiol bildar ett tunt lager av homogen tjocklek när locket glider placeras på droppen. Normalt finns det ingen anledning att trycka på provet. Om du vill använda icke-immersion linser är provet redo för inspektion.För mikroskopisk analys med nedsänkning linser, låt provet torka i ca 1 timme tills Mowiol har stelnat i kanten av provet.
4. Förbereda nät för svepelektronmikroskop (SEM)
- Inlägg fixa celler på glider skyddsglaset i 24-brunnar med 2,5% glutaraldehyd.
- Ta bort glider skyddsglaset innehåller celler från 24-och kultur plattan och sätta upp och ner på en droppe vatten. Tvätta gillar det här 3 gånger i 5 min.
- Överför täckglas tillbaka till 24-och cellodling skylt som innehåller 0,5% OsO4 och inkubera i 30 min.
- Ta bort glider skyddsglaset innehåller celler från 24-och kultur plattan och sätta upp och ner på en droppe vatten. Tvätta gillar det här 3 gånger i 5 min.
- Överför täckglas tillbaka till 24-och cellodling skylt som innehåller 1% garvsyra och inkubera i 30 min.
- Upprepa steg från 4,2 till 4,4
- Torka genom följande regim (5min vardera):
- 30% etanol
- 50% etanol
- 70% etanol
- 80% etanol
- 90% etanol
- 100% etanol
- 100% etanol
- 100% etanol
- Överför täckglas i kritiska punkten torktumlaren och torrt prov.
- Coat yta av prov med 5nm Platin / kol lager med tunt lager förångare
5. Representativa resultat:
Isoleringen metod ger oftast ostimulerade livskraftiga neutrofiler med en renhet på över 95%. När fast vid olika tidpunkter efter stimulering visar immunfärgning protokoll den sekvens av morfologiska förändringar under NETosis cell plattas, förlust av kärnkraft lobules, förlust av granulat och kärna integritet som leder till en ökande överlappning av kärnvapen (dvs. histon) och granulat (dvs. neutrofila Elastase) missfärgning. Detta protokoll kan tjäna som utgångspunkt för att analysera specifika interaktioner av patogener med neutrofiler. Denna interaktion kan dissekeras mer i detalj med hjälp av förberedelserna protokoll för Svepelektronmikroskopi.
NET Fluorescens
Exempel på stimuleras neutrofiler färgas för NET-komponenter (blå = DNA, röd = histoner, grön = neutrofila Elastase). Bilderna visar, förutom NET lokalisering, de nukleära lokalisering av DNA och histoner och granulat av mönster för neutrofila Elastase.
SEM PMA stimulering
Skanning elektron mikroskop visar inte stimuleras och PMA-stimulerade neutrofiler. Efter stimulering, det neutrofiler platta ut och producera NET.
SEM NET och Shigella
Högre upplösning SEM-bild av Shigella bakterier fastnar i nät.
Discussion
Den medföljande protokollet blir det möjligt isolering av icke stimuleras neutrofiler vid stor renhet, induktion av NET bildning och analys av morfologiska förändringar under NETosis. Vid hantering av prover med omsorg, det vill säga att undvika hårda tvätt förhållanden som kommer att resultera i förlust av de flesta av de löst bifogade NET, kan mängden NET bildas under olika stimulering villkor (varaktighet, stimulus) jämföras. I detta avseende kan den medföljande protokoll fungera som en utgångspunkt för att fastställa metoder för att analysera mer avancerade scenarion: neutrofila / patogen interaktioner, sekvens av stimuli, samspel med andra immunceller.
References
- Brinkmann, V. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.
- Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms. Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).
- M, E. Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps. PNAS. 106, 6748-6753 (2009).
- Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps. Curr Biol. 14, 396-400 (2006).
- Fuchs, T. A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).
- Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major. J Immunol. , 169-898 (2002).
