Summary
الفخاخ خارج الخلية العدلات (شبكات) هي آلية هامة لمكافحة المناعة الفطرية المسببة للأمراض البكتيريا والفطريات والطفيليات. نحن هنا وصف الأساليب المحببة لعزل العدلة من دم الإنسان وتفعيلها على شكل الشباك. نقدم تقنيات إعداد تصور المستجدة في ضوء الفحص المجهري والإلكترون.
Abstract
العدلة المحببة هي المجموعة الأكثر وفرة من الكريات البيض في الدم المحيطي. كما البالعات المهنية ، فإنها تبتلع البكتيريا وقتلهم عندما intracellularly فتيل هذه الميكروبات مع حبيبات يبلوع. وجدنا أن العدلات وسيلة إضافية لقتل الكائنات الحية الدقيقة : عند التنشيط ، التي يطلقون البروتينات الحبيبية والتي تشكل معا لونين ألياف خارج الخلية التي تربط مسببات الأمراض. هذه الهياكل رواية ، أو الفخاخ خارج الخلية العدلات (شبكات) ، تتحلل عوامل الفوعة وقتل البكتيريا 1 ، 2 الفطريات والطفيليات 3. العمود الفقري الهيكلية المستجدة هو الحمض النووي ، وأنها تتدهور بسرعة في وجود DNases. وهكذا ، معربا عن DNases البكتيريا هي أكثر خبثا 4. باستخدام المجهر مترابط يجمع TEM ، SEM ، المناعي والعيش تقنيات التصوير الخلية ، ويمكن أن نعرض على التحفيز ، ونوى العدلات تفقد شكلها والتجانس في الاتحاد الأوروبي والمغاير. في وقت لاحق ، المغلف النووية والأغشية الحبيبية تتفكك السماح للخلط مكونات NET. أخيرا ، يتم الإفراج عن المستجدة كما في فواصل غشاء الخلية. هذا البرنامج موت الخلية (NETosis) يختلف عن موت الخلايا المبرمج والنخر ، وتعتمد على توليد أنواع الاكسجين التفاعلية التي NADPH أوكسيديز 5.
الفخاخ خارج الخلية العدلات وفيرة في مواقع الالتهاب الحاد. المستجدة ويبدو أن شكلا من أشكال الاستجابة المناعية الفطرية التي تربط الكائنات الحية الدقيقة ، ومنعهم من الانتشار ، وضمان وجود تركيز عال المحلية العوامل المضادة للميكروبات أن تتحلل عوامل الفوعة وقتل مسببات الأمراض وبالتالي السماح للوفاء العدلات المضادة للجراثيم وظيفتها حتى بعد فترة حياتها. هناك أدلة متزايدة ، ومع ذلك ، وتشارك أيضا في الأمراض المستجدة التي تتراوح من المناعة الذاتية متلازمات 6 إلى العقم.
نحن تصف الأساليب المحببة لعزل العدلات المحيطية 7 من الدم البشري وتحفيز لهم لتشكيل الشباك. كما أننا تشمل بروتوكولات لتصور المستجدة في ضوء الفحص المجهري والإلكترون.
Protocol
1. PMN عزل من دم الإنسان
حول استخدام دم الإنسان 24 مل مع EDTA أو الهيبارين (10 يو / مل) ، وتخثر.
- إضافة Histopaque 6 مل 1119 لأنبوب 15 مل فالكون والدم بعناية طبقة مل 5-7 كلها على القمة.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 800 XG دون الكبح.
- نضح وتجاهل الطبقة العليا الصفرة واضحة ونقل المرحلة التي تحتوي على أقل المحمر المحببة في أنابيب فالكون الطازجة.
- غسل الخلايا ملء أنابيب فالكون مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في غرام × 300
- في غضون ذلك يعد حلا Percoll 100 ٪ عن طريق خلط 18 مل مع Percoll PBS 2 مل 10X. مع 1X PBS إعداد الحلول 4 مل من 85 ٪ ، 80 ٪ ، 75 ٪ ، 70 ٪ و 65 ٪ Percoll.
- 2 إعداد أنابيب فالكون مع التدرج Percoll بواسطة 2 مل من كل الطبقات مئوية على رأس كل منهما الآخر في خفض الطلب.
- بعد الطرد المركزي إزالة طاف ، والجمع بين الكريات والخلايا resuspend الرسوبية في 4 مل من برنامج تلفزيوني.
- بعناية طبقة 2 مل من إعادة تعليق على كل من التدرجات.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 800 XG دون الكبح.
- بعد الطرد المركزي إزالة الطبقة العليا ومعظم الطبقة 65 ٪ مع PBMCs وجمع البيض interphases المتبقية حتى الطبقة 85 ٪ في أنابيب فالكون الجديد.
- غسل الخلايا ملء الأنابيب فالكون مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في غرام × 300
- إزالة الخلايا الرسوبية وطاف resuspend (عادة> 95 ٪ من PMN) في 2ml من برنامج تلفزيوني.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
2. تفعيل PMNs
- تعد زراعة الخلايا بشكل جيد 24 لوحة عن طريق وضع معقم 13 مم غطاء زجاجي الجولة زلة (# 1،5) في كل بئر
- البذور 2 × 10 5 الخلايا في RPMI 500μl (التي تحتوي على 2 ٪ الإنسان مصل الزلال) لكل بئر واحتضان ل1H CO 2 في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
- وفي الوقت نفسه يعد ب 600 نانومتر في حل PMA RPMI وإضافة إلى خلايا 100μl لكل بئر. احتضان من 15 دقيقة تصل إلى 4 ساعات في CO 2 الحاضنة في 37 درجة مئوية.
- إصلاح الخلايا في 4 ٪ (تركيز النهاية) بارافورمالدهيد الذائبة في برنامج تلفزيوني.
سلطة النقد الفلسطينية بمثابة مراقبة إيجابية ، وحتى الآن أقوى عامل للحث على تشكيل NET. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام منبهات أخرى أو شارك في زراعة ، مع الممرضة لتحريض NET.
يمكن التحقق منها من حالة تشكيل NET بينما دوام يسير ، إذا كان قد أعد عينات إضافية موازية. إذا تم إضافة صبغة الحمض النووي غير نفيذ مثل الأخضر Sytox (Invitrogen) إلى خلايا غير ثابت ، وسوف يتم الكشف عن الحمض النووي خارج الخلية فقط. منذ نحو ما هو اعاقة تشكيل نتس في حضور Sytox ، لمرة واحدة لكل نقطة عينة موازية له لاستخدامه.
3. NET الكشف عن طريق immunolabeling
المستجدة هشة للغاية حتى بعد التثبيت ، ويجب معالجته بعناية كبيرة ، وإلا سوف تضيع هذه الغالبية خلال التحضير.
- إزالة بعناية ينزلق الغطاء الزجاجي مع الخلايا المرفق من لوحة الثقافة 24 جيد من خلال رفع الامر على حافة مع إبرة مقوسة والاستيلاء عليه مع ملقط الغرامة. وضع زلة تغطية رأسا على عقب على قطرة من برنامج تلفزيوني. هذا يمكن القيام به على ورقة تغطي Parafilm موقفا أنبوب اختبار. غسل مثل هذا 3 مرات لمدة 5 دقائق.
- احتضان زلات تغطية بالطريقة نفسها إلى انخفاض قدره 0.5 ٪ تريتون X - 100 لمدة 1 دقيقة في لRT permeabilize الخلايا. تغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 1 دقيقة.
- تعد الغرفة الرطبة مع Parafilm والنسيج الرطب. وضع غطاء ينزلق رأسا على عقب على قطرة من حجب العازلة (5 ٪ حمار المصل) ويحضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية ، مثل هيستون مللي المضادة والمعادية RB إيلاستاز العدلات ، في عرقلة العازلة.
- نقل تغطية زلات في الغرفة الرطبة العازلة مباشرة من حظر على قطرة من الأجسام المضادة الأولية واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- تغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني.
- تمييع الأجسام المضادة الثانوية ، على سبيل المثال لا أعرف مللي Cy2 المضادة والمعادية DK RB Cy3 ، في عرقلة العازلة.
- نقل تغطية ينزلق الى غرفة رطبة على قطرة من الأجسام المضادة الثانوية واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- تغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني. اعتمادا على خياراتك المجهري مضان ، الحمض النووي وصمة عار لمدة 5 دقائق إما مع هويشت 33342 (1 ميكروغرام / لتر) والتي سوف تحتاج الإثارة أو الأشعة فوق البنفسجية مع Draq5 عن الإثارة الحمراء البعيدة ويغسل مرتين مع شعبة نظم. الماء.
- وضع قطرة من 20μl Mowiol على شريحة زجاجية وجبل لتغطية زلات مع الخلايا رأسا على عقب. الخلايا يجب أن تكون بين زلة تغطية وحرك. فإن قطرة من Mowiol شكل طبقة رقيقة من سمك متجانسة عندما يتم وضع غطاء على زلة الهبوط. عادة ، ليست هناك حاجة للضغط على العينة. إذا كنت ترغب في عدم استخدام الغمر العدسات ، ومستعد عينة للفحص.لتحليلها مع العدسات المجهرية الغمر ، والسماح للعينة الجافة لحوالي 1 ساعة حتى Mowiol وقد عززت عند حافة العينة.
4. إعداد المستجدة للالمجهر الإلكتروني (SEM)
- آخر إصلاح الخلايا على زلات الغطاء الزجاجي في 24 لوحة جيدا مع غلوتارالدهيد 2،5 ٪.
- زلات إزالة الغطاء الزجاجي يحتوي على خلايا من لوحة الثقافة 24 وكذلك وضعت رأسا على عقب على قطرة ماء. غسل مثل هذا 3 مرات لمدة 5 دقائق.
- نقل ينزلق الغطاء الخلفي إلى جانب 24 لوحة الخلية التي تحتوي على 0،5 ٪ الثقافة OsO4 واحتضان لمدة 30 دقيقة.
- زلات إزالة الغطاء الزجاجي يحتوي على خلايا من لوحة الثقافة 24 وكذلك وضعت رأسا على عقب على قطرة ماء. غسل مثل هذا 3 مرات لمدة 5 دقائق.
- نقل ينزلق الغطاء الخلفي إلى جانب 24 لوحة الثقافة الخلية التي تحتوي على حمض التانيك 1 ٪ ، واحتضان لمدة 30 دقيقة.
- كرر الخطوات من 4،2-4،4
- يذوى من خلال نظام التالية (5min لكل منهما) :
- 30 ٪ من الإيثانول
- 50 ٪ من الإيثانول
- 70 ٪ من الإيثانول
- 80 ٪ من الإيثانول
- 90 ٪ من الإيثانول
- 100 ٪ من الإيثانول
- 100 ٪ من الإيثانول
- 100 ٪ من الإيثانول
- نقل تغطية ينزلق إلى نقطة حرجة مجفف والعينات الجافة.
- سطح طبقة من العينة مع طبقة platin / الكربون 5nm باستخدام طبقة رقيقة المبخر
5. ممثل النتائج :
أسلوب العزل عادة غلات العدلات unstimulated قابلة للحياة مع نقاء أكثر من 95 ٪. عندما ثابتة عند نقاط زمنية مختلفة بعد التحفيز ، وبروتوكول immunostaining يبين تسلسل التغيرات المورفولوجية خلال خلية NETosis تسطيح ، وفقدان فصيصات النووية ، وفقدان النزاهة والحبيبية النواة مما يؤدي إلى نوع من التداخل المتزايد من أي (النووية (أي هيستون) والحبيبية العدلة إيلاستاز) تلطيخ. يمكن لهذا البروتوكول بمثابة نقطة الانطلاق لتحليل التفاعلات بين العوامل المسببة للأمراض محددة مع العدلات. يمكن تشريح هذا التفاعل بمزيد من التفصيل باستخدام بروتوكول التحضير للالمجهر الإلكتروني.
NET الإسفار
عينة من العدلات حفز الملون لمكونات NET (الأزرق = الحمض النووي ، وأحمر = = الخضراء هيستون إيلاستاز العدلات). وتظهر الصور ، بالإضافة إلى توطين NET ، وتوطين النووي DNA وhistones ونمط محبب للإيلاستاز العدلات.
SEM PMA التحفيز
صورة مجهرية الإلكترون المسح تبين عدم العدلات حفز وتنشيط سلطة النقد الفلسطينية. بعد التحفيز ، وتتسطح بها والعدلات انتاج الشباك.
SEM المستجدة والشيغيلة
أعلى صورة SEM القرار من البكتيريا الشيغيلة المحاصرين في الشباك.
Discussion
وسوف يسمح البروتوكول شريطة عدم عزل العدلات حفز على نقاء كبير ، وتحريض تشكيل NET ، وتحليل التغيرات المورفولوجية خلال NETosis. عند التعامل مع العينات بعناية ، وتجنب أي ظروف قاسية الغسيل ، مما سيؤدي إلى فقدان أكثر من شبكات فضفاضة يعلق ، يمكن مقارنة كمية تشكيل NET في ظل ظروف مختلفة التحفيز (المدة ، والتحفيز). في هذا الصدد ، يمكن للبروتوكولات المنصوص بمثابة نقطة انطلاق لإنشاء طرق لتحليل سيناريوهات أكثر تعقيدا : التفاعلات العدلة / الممرض ، وتسلسل من المحفزات ، تتفاعل مع الخلايا المناعية الأخرى.
References
- Brinkmann, V. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.
- Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms. Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).
- M, E. Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps. PNAS. 106, 6748-6753 (2009).
- Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps. Curr Biol. 14, 396-400 (2006).
- Fuchs, T. A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).
- Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major. J Immunol. , 169-898 (2002).
