Summary
Neutrofielen extracellulaire Vallen (NET's) zijn een belangrijk aangeboren immuun mechanisme om pathogene bacteriën, schimmels en parasieten te bestrijden. Hier beschrijven we methoden om neutrofiele granulocyten isoleren uit menselijk bloed en ze te activeren om netten te vormen. We presenteren bereidingstechnieken aan netten in licht-en elektronenmicroscopie te visualiseren.
Abstract
Neutrofiele granulocyten zijn de meest voorkomende groep van leukocyten in het perifere bloed. Als professionele fagocyten, zij overspoelen bacteriën en intracellulair doden wanneer hun antimicrobiële granules versmelten met het fagosoom. Wij vonden dat neutrofielen een extra manier van het doden van micro-organismen hebben: bij activering, geven ze granule eiwitten en chromatine die samen extracellulaire vezels die zich binden ziekteverwekkers. Deze nieuwe structuren, of neutrofielen extracellulaire Traps (NET), af te breken virulentiefactoren en doodt bacteriën 1, 2 schimmels en parasieten 3. De structurele ruggengraat van NET is DNA, en ze worden snel afgebroken in de aanwezigheid van DNases. Zo, bacteriën uitdrukken DNases zijn meer virulent 4. Met behulp van correlatieve microscopie combinatie van TEM, SEM, immunofluorescentie en live cell imaging technieken, kunnen we zien dat bij stimulatie, de kernen van neutrofielen hun vorm verliezen en de eu-en heterochromatine homogeniseren. Later, de nucleaire envelop en de korrel membranen desintegreren waardoor de menging van NET-componenten. Tot slot worden de netten vrijgegeven als het celmembraan breekt. Dit celdood programma (NETosis) onderscheidt zich van apoptose en necrose en is afhankelijk van de generatie van zuurstofradicalen door NADPH oxidase 5.
Neutrofielen extracellulaire vallen zijn overvloedig op plaatsen van een acute ontsteking. NET lijkt een vorm van aangeboren immuunrespons zijn die zich binden micro-organismen, verbreiding ervan te voorkomen, en zorgen voor een hoge lokale concentratie van antimicrobiële stoffen teneinde virulentiefactoren af te breken en zo te doden pathogenen waardoor neutrofielen aan hun antimicrobiële functie te vervullen, zelfs boven hun levensduur. Er is bewijs toe, echter dat NET ook betrokken bij ziekten die variëren van auto-immune syndromen tot onvruchtbaarheid 6.
Beschrijven we methoden om neutrofiele granulocyten isoleren uit perifeer menselijk bloed 7 en hen stimuleren om NET te vormen. Ook hebben we onder andere protocollen om de netten te visualiseren in licht-en elektronenmicroscopie.
Protocol
1. PMN Isolatie uit menselijk bloed
Gebruik ongeveer 24 ml menselijk bloed met EDTA of heparine (10 U / ml) als antistollingsmiddel.
- Voeg 6 ml Histopaque 1119 naar een 15 ml Falcon buis en zorgvuldig laag 5 à 7 ml bloed op de top.
- Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 800 xg zonder remmen.
- Zuig en gooi gelig en helder toplaag en de overdracht lagere roodachtige fase die granulocyten in de frisse Falcon buizen.
- Was cellen door te tanken Falcon buizen met PBS en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.
- In de tussentijd bereiden een 100% Percoll-oplossing door het mengen van 18 ml Percoll met 2 ml 10x PBS. Met 1x PBS bereiden 4 ml oplossingen van 85%, 80%, 75%, 70% en 65% Percoll.
- Bereid twee Falcon buizen met een Percoll gradiënt door gelaagdheid 2 ml van elk procentpunt boven op elkaar in aflopende volgorde.
- Na het centrifugeren de bovenstaande vloeistof, combineren pellets en resuspendeer gesedimenteerd cellen in 4 ml PBS.
- Voorzichtig laag 2 ml van de resuspensie op elk van de gradiënten.
- Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 800 xg zonder remmen.
- Na het centrifugeren verwijderd bovenste laag en de meeste van de 65%-laag met PBMC's en het verzamelen van de resterende witte interfasen tot 85%-laag in de nieuwe Falcon buizen.
- Was cellen door het opvullen van de Falcon buizen met PBS en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.
- Verwijder supernatant en resuspendeer gesedimenteerd cellen (gewoonlijk> 95% zijn PMN) in 2 ml PBS.
- Tellen cellen met behulp van een hemocytometer.
2. Het activeren van PMN's
- Bereid een 24-well plaat celkweek door er een steriele 13 mm ronde glazen dekglas (# 1,5) in elk putje
- Seed 2 x 10 5 cellen in 500μl RPMI (met 2% humaan serumalbumine) per goed en voor 1 uur in CO 2 incubator bij 37 ° C. incubeer
- Ondertussen bereiden een 600 nM PMA-oplossing in RPMI en toe te voegen aan cellen 100μl per well. Incubeer van 15 min tot 4 uur in CO 2-incubator bij 37 ° C.
- Fix cellen in 4% (eind concentratie) paraformaldehyde opgelost in PBS.
PMA fungeert als een positieve controle en is tot nu toe de meest krachtige agent NET vorming induceren. Als alternatief kunnen andere stimuli of co-teelt met pathogenen worden gebruikt voor NET-inductie.
De respectieve status van de NET-vorming kan worden gecontroleerd, terwijl het tijdsverloop verloopt, als extra parallelle monsters worden voorbereid. Als een niet-permeant DNA kleurstof zoals Sytox Green (Invitrogen) wordt toegevoegd aan de niet-vaste cellen, wordt alleen extracellulaire DNA worden gedetecteerd. Sinds de oprichting van de nieuwe NET's is een of andere manier aangetast in de aanwezigheid van Sytox, voor elk tijdstip een parallel monster moet worden gebruikt.
3. NET detectie door immunokleuring
NET's zijn erg kwetsbaar, zelfs na fixatie en moeten worden gemanipuleerd met grote zorg, omdat anders de meerderheid zal verloren gaan tijdens de voorbereiding.
- Verwijder voorzichtig glazen dekglaasjes met aangehechte cellen van 24-well plaat cultuur door op te tillen aan de rand met een gebogen naald en grijpen met een fijne pincet. Plaats het deksel glijden ondersteboven op een daling van PBS. Dit kan worden gedaan op een Parafilm blad die een reageerbuis staan. Wassen als dit 3 keer voor vijf minuten.
- Incubeer dekglaasjes op dezelfde manier in een daling van 0,5% Triton X-100 voor een min bij RT aan cellen permeabilize. Was drie keer in PBS gedurende 1 minuut.
- Bereid een vochtige kamer met Parafilm en een natte doek. Leg de dekglaasjes ondersteboven op een daling van blokkerende buffer (5% ezel serum) en gedurende 30 minuten bij 37 ° C. incubeer
- Verdunnen primaire antilichamen, bijvoorbeeld ms anti Histon en rb anti neutrofiel elastase, in het blokkeren van buffer.
- Overdracht direct dekglaasjes in de vochtige kamer van het blokkeren van buffer op een daling van de primaire antilichaam en gedurende 1 uur bij 37 ° C. incubeer
- Was drie keer voor 5 min met PBS.
- Verdunnen secundaire antilichamen, bijvoorbeeld dk anti ms Cy2 en dk anti rb Cy3, in het blokkeren van buffer.
- Overdracht dekglaasjes in de vochtige kamer op een daling van secundaire antilichaam en gedurende 1 uur incuberen bij 37 ° C.
- Was drie keer voor 5 min met PBS. Afhankelijk van uw fluorescentie microscopie opties, vlekken DNA gedurende 5 minuten, ofwel met Hoechst 33342 (1 ug / ml) die UV-excitatie of met Draq5 voor veel rode excitatie nodig en was twee keer met dist. het water.
- Stel een 20μl druppel Mowiol op een glasplaatje en monteer dekglaasjes met cellen op zijn kop. De cellen moeten worden tussen het dekglas en de glijbaan. De daling van Mowiol vormen een dunne laag van homogene dikte als het dekglas is geplaatst op de drop. Normaal gesproken is er geen noodzaak om het monster te drukken. Als u wilt niet-onderdompeling lenzen te gebruiken, het monster is klaar voor inspectie.Voor de microscopische analyse met onderdompeling lenzen, laat het monster drogen ongeveer 1 uur totdat de Mowiol is gestold aan de rand van het monster.
4. Voorbereiden NET voor Scanning Electron Microscopy (SEM)
- Bericht fix cellen op de glazen dekglaasjes in 24-wells plaat met 2,5% glutaaraldehyde.
- Verwijder de glazen dekglaasjes met cellen van 24-well plaat en cultuur zetten ondersteboven op een druppel water. Wassen als dit 3 keer voor vijf minuten.
- Terug te zetten dekglaasjes in 24-well celkweek plaat met 0,5% OsO4 en incubeer gedurende 30 minuten.
- Verwijder de glazen dekglaasjes met cellen van 24-well plaat en cultuur zetten ondersteboven op een druppel water. Wassen als dit 3 keer voor vijf minuten.
- Terug te zetten dekglaasjes in 24-well celkweek plaat met 1% looizuur en incubeer gedurende 30 minuten.
- Herhaal de stappen 4,2 tot 4,4
- Ontwateren door middel van de volgende behandeling (5min elk):
- 30% ethanol
- 50% ethanol
- 70% ethanol
- 80% ethanol
- 90% ethanol
- 100% ethanol
- 100% ethanol
- 100% ethanol
- Overdracht dekglaasjes in kritieke punt droger en droge monsters.
- Laag het oppervlak van het monster met 5nm Platin / carbon laag met behulp van dunne laag verdamper
5. Representatieve resultaten:
De isolatie methode levert meestal niet gestimuleerde neutrofielen haalbaar met een zuiverheid van meer dan 95%. Wanneer vastgesteld op verschillende tijdstippen na stimulatie, de immunokleuring protocol geeft de volgorde van de morfologische veranderingen tijdens NETosis cel afvlakking, verlies van nucleaire melkklieren, verlies van korrel en kern integriteit die leidt tot een toenemende overlap van de nucleaire (dat wil zeggen histon) en granulaire (dat wil zeggen neutrofiel elastase) kleuring. Dit protocol kan dienen als een startpunt om de specifieke interacties van pathogenen met een aantal neutrofielen te analyseren. Deze interactie kan worden ontleed in meer detail met behulp van de voorbereiding protocol voor Scanning Electron Microscopy.
NET Fluorescentie
Voorbeeld van gestimuleerde neutrofielen gekleurd voor NET-componenten (blauw = DNA, rood = histon, groen = neutrofiel elastase). De beelden tonen, naast de NET lokalisatie, de nucleaire lokalisatie van DNA en histonen en de korrelige patroon voor neutrofiel elastase.
SEM PMA stimulatie
Scanning electronen microscoop toont niet gestimuleerd en PMA-gestimuleerde neutrofielen. Na stimulatie, de neutrofielen plat uit en produceren netten.
SEM NET en Shigella
Hogere resolutie SEM beeld van Shigella bacteriën gevangen in netten.
Discussion
De verstrekte protocol zal de isolatie van niet-gestimuleerde neutrofielen tot grote zuiverheid, de inductie van NET vorming en de analyse van de morfologische veranderingen tijdens NETosis. Bij het hanteren van de monsters met zorg, dat wil zeggen het wassen barre omstandigheden die zal resulteren in het verlies van de meeste van de los bijgevoegde NET te vermijden, kan het bedrag van de netto formatie onder verschillende omstandigheden stimulatie (duur, stimulus) worden vergeleken. In dit opzicht kan de bijgeleverde protocollen dienen als een startpunt om methoden te ontwikkelen om meer geavanceerde scenario's te analyseren: neutrofielen / pathogeen interacties, volgorde van stimuli, wisselwerking met andere immuuncellen.
References
- Brinkmann, V. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.
- Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms. Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).
- M, E. Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps. PNAS. 106, 6748-6753 (2009).
- Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps. Curr Biol. 14, 396-400 (2006).
- Fuchs, T. A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).
- Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major. J Immunol. , 169-898 (2002).
