Summary
好中球細胞外トラップ（NETS）は、病原性細菌、真菌、寄生虫を戦うために重要な自然免疫機構です。ここでは、ヒトの血液から好中球顆粒球を分離するやネットを形成するためにそれらを有効にする方法を説明します。我々は、光と電子顕微鏡内のネットを可視化する準備のテクニックを紹介。
Abstract
好中球顆粒球は、末梢血中の白血球の最も豊富に存在するグループです。プロの食細胞として、彼ら巻き込む細菌とその抗菌顆粒はファゴソームと融合するときに細胞内にそれらを殺す。活性化により、彼らは一緒に病原体に結合する細胞外繊維を形成顆粒のタンパク質とクロマチンを解放：私たちは、その好中球が微生物を殺すの追加の方法を持っています。これらの新規な構造、または好中球細胞外トラップは（NETS）、病原性因子を低下させ、細菌1、真菌2および寄生虫3を殺す。ネットの構造骨格はDNAであり、そして彼らはDNasesの存在下で速やかに分解される。従って、DNasesを表現する細菌は、4より病原性があります。 TEM、SEM、免疫蛍光法および生細胞イメージング技術を組み合わせて相関顕微鏡を用いて、我々は、刺激によって、好中球の核は、その形状を失うとEUとヘテロクロマチンが均質化することを示している可能性があります。その後、核膜と顆粒膜は、NETコンポーネントの混合を可能に崩壊する。最後に、NETSは、細胞膜の区切りとしてリリースされています。この細胞死のプログラム（NETosis）は、アポトーシスとネクローシスとは区別され、NADPHオキシダーゼ5による活性酸素種の生成に依存する。
好中球細胞外トラップは、急性炎症のサイトで豊富です。 NETSは、バインドの微生物という、拡散を防ぐ、および病原性因子を分解し、好中球は、さらに彼らの寿命を超えて、その抗菌機能を発揮できるようにするため、病原体を殺すために抗菌剤の高い局所濃度を確保する自然免疫応答の形のように見える。証拠が高まっている、しかし、そのネットもその疾患に関与している自己免疫症候群から不妊6の範囲。
我々は、末梢ヒト血液の7から好中球顆粒球を分離し、NETSを形成するためにそれらを刺激する方法を説明します。また、我々は、光と電子顕微鏡内のネットを視覚化するプロトコルが含まれます。
Protocol
1。ヒト血液からPMN分離
抗凝固剤としてEDTAまたはヘパリン（10 U / ml）で約24ミリリットルのヒトの血液を使用してください。
- 15ミリリットルファルコンチューブに6ミリリットルHistopaque 1119を追加し、慎重にレイヤ上に5〜7ミリリットルの全血。
- ブレーキなしで800 × gで20分間遠心する。
- 吸引して廃棄黄色と透明な上部層を、新鮮なファルコンチューブに顆粒球を含む低赤相を転送する。
- 300 × gで10分間PBSと遠心機でファルコンチューブを充填することにより細胞を洗浄
- その間に2ミリリットル10倍PBSで18 mlのパーコールを混合して100％のパーコール溶液を調製。 1X PBSは85％、80％、75％、70％、65％パーコール4mlの溶液を調製して。
- 降順で互いの上にすべての割合のレイヤー2ミリリットルでPercoll勾配で2ファルコンチューブを準備します。
- 遠心分離上清を除去した後、PBS 4 mlでペレットを再懸濁します沈降した細胞を組み合わせる。
- グラデーションの各上に再懸濁の慎重にレイヤ2ミリリットル。
- ブレーキなしで800 × gで20分間遠心する。
- 遠心分離後に末梢血単核細胞でトップ層は65％層の大部分を削除し、新たなファルコンチューブに85％層まで、白残りinterphasesを収集する。
- PBSと300 × gで10分間、遠心分離でファルコンチューブを充填することにより細胞を洗浄
- PBSの2ミリリットルで上清と再懸沈殿細胞を（通常> 95％がPMNいる）を取り外します。
- 血球計算板を用いて細胞を数える。
2。アクティベーションPMNは
- 各ウェルに滅菌した13ミリメートル円形のガラスカバースリップ（＃1,5）を置くことによって、24ウェル細胞培養プレートを準備します。
- シード2ウェルあたり500μLRPMIで× 10 5細胞（ヒト血清アルブミン2％を含む）と37℃CO 2インキュベーターで1時間インキュベート℃に
- 一方RPMIに600 nMのPMA溶液を調製し、ウェルあたり100μlの細胞に加える。 37℃までCO 2インキュベーター内で4時間まで15分のインキュベート℃まで
- PBSに溶解した4％（最終濃度）パラホルムアルデヒドで細胞を固定する。
PMAは、ポジティブコントロールとして機能し、これまでNET形成を誘導するための最も強力なエージェントです。また、病原体と他の刺激または共培養は、NET誘導に使用することができます。
追加のパラレルサンプルが用意されている場合、時間の経過は、進行している間、NET形成のそれぞれの状態を確認することができます。 SYTOXグリーン（Invitrogen社）のような非透過性のDNA色素は非固定細胞に添加されている場合は、唯一の細胞外DNAが検出されます。新しいネットの形成以来、何らかの形で、各時点ごとに1つのパラレルサンプルを使用する必要がある、SYTOXの存在下で低下している。
3。免疫標識NETの検出
ネットがさらに固定後に非常に壊れやすく、大半が準備中に迷子になるそうでなければ、細心の注意を払って操作する必要があります。
- 慎重にカーブした針で端にそれを持ち上げて、24ウェル培養プレートから添付された細胞とガラスカバースリップを削除し、微細な鉗子でそれをつかむ。 PBSのドロップに逆さまにカバースリップを置く。これは、試験管のスタンドを覆うパラフィルムシートで行うことができます。このような5分間3回洗浄する。
- トリトンX - 100室温で1分間、細胞を透過性に0.5％の低下で同じようにカバースリップをインキュベートする。 1分間PBSで3回洗浄する。
- パラフィルムやウェットティッシュで湿度の高い部屋を準備します。カバーは、ブロッキングバッファー（5％ロバ血清）のドロップに逆さま伝票はレイと37℃で30分間インキュベート℃に
- ブロッキングバッファーで一次抗体、例えば、MS抗ヒストンとRB抗好中球エラスターゼを、希釈する。
- 一次抗体の低下にブロッキングバッファーから直接湿度の高い部屋でスリップをカバーし、37℃で1時間インキュベート転送℃に
- PBSで5分間3回洗浄する。
- 二次抗体、例えばDKアンチMS Cy2とし、ブロッキング緩衝液でDK抗RBのCy3を、希釈する。
- 37℃で1時間二次抗体とインキュベートのドロップ℃の上に湿潤なチャンバにカバースリップを転送する
- PBSで5分間3回洗浄する。染色DNAはUV励起または遠赤色励起のためのDRAQ5とを必要とdistで二回洗うヘキスト33342（1μg/ mlの）のいずれかで5分間、あなたの蛍光顕微鏡のオプションによって異なります。水。
- スライドガラス上にMowiolの20μlのドロップを設定し、逆さまに細胞をカバースリップをマウントします。細胞がカバーガラスとスライドの間にあることがあります。 Mowiolのドロップは、カバースリップがドロップで配置される均質な厚さの薄層を形成することになる。通常は、サンプルを押す必要はありません。あなたが非液浸レンズを使用する場合、試料は、検査の準備ができています。液浸レンズと顕微鏡分析のために、Mowiolは、サンプルの端に固化するまで約1時間のための試料は乾燥させて。
4。走査型電子顕微鏡のための準備NETS（SEM）
- 2,5％のグルタルアルデヒドで24ウェルプレートにガラスカバースリップ上に細胞を固定ポスト。
- 24ウェル培養プレートから細胞を含むガラスカバースリップを外し、水滴に逆さまに置く。このような5分間3回洗浄する。
- 30分間0.5％OsO4とインキュベートを含む24ウェル細胞培養プレートに戻してカバースリップを転送します。
- 24ウェル培養プレートから細胞を含むガラスカバースリップを外し、水滴に逆さまに置く。このような5分間3回洗浄する。
- バック30分で1％タンニン酸とインキュベートを含む24ウェル細胞培養プレートにカバースリップを転送する。
- 繰り返しのステップ4.2から4.4
- 以下のレジメン（5分ごとに）を介して脱水。
- 30％エタノール
- 50％エタノール
- 70％エタノール
- 80％エタノール
- 90％エタノール
- 100％エタノール
- 100％エタノール
- 100％エタノール
- 臨界点乾燥機と乾燥試料中にスリップをカバー転送する。
- 薄層蒸発器を使用して5nmのプラチン/カーボン層を持つ試料のコートの表面
5。代表的な結果：
分離方法は、通常95％より高い純度を持つ無刺激の実行可能な好中球が得られます。刺激後の異なる時点で固定したとき、免疫染色のプロトコルはNETosisの平坦化細胞、核の小葉の喪失、顆粒の消失と核（ヒストンすなわち）と粒状の（すなわちの増加重複につながる核の完全性の間に形態学的変化のシーケンスを示しています。好中球エラスターゼ）染色。このプロトコルは、好中球による病原体の特異的な相互作用を分析する出発点として利用することもできます。この相互作用は、走査型電子顕微鏡のための準備のプロトコルを使用してより詳細に解剖することができます。
NET蛍光
NETコンポーネント（青= DNA、赤=ヒストン、緑=好中球エラスターゼ）について染色刺激好中球のサンプル。画像はNETローカリゼーション、DNAとヒストンの核局在化と好中球エラスターゼのための顆粒状パターンのほかに、表示されます。
SEM PMA刺激
非刺激およびPMA -刺激好中球を示す電子顕微鏡写真をスキャン。刺激後、好中球は平らにならすとネットを生成する。
SEMネットと赤痢菌
NETSの中に閉じ込め赤痢菌の高分解能SEM像。
Discussion
提供するプロトコルでは、かなりの純度で非刺激好中球の分離、NET形成の誘導とNETosis時の形態学的変化の解析が可能になります。つまり、緩く接続されたネットのほとんどが失われます過酷な洗浄条件を避け、慎重に試料を取り扱うときは、別の刺激条件下でのNETの形成（持続時間、刺激）の量を比較することができます。好中球/病原体相互作用、刺激の順序、他の免疫細胞との相互作用：この点において、提供されているプロトコルは、より洗練されたシナリオを分析する手法を確立するための出発点として利用することもできます。
References
- Brinkmann, V. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.
- Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms. Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).
- M, E. Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps. PNAS. 106, 6748-6753 (2009).
- Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps. Curr Biol. 14, 396-400 (2006).
- Fuchs, T. A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).
- Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major. J Immunol. , 169-898 (2002).
