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Neuroscience

곤충의 단일 Sensillum 레코딩 Drosophila melanogaster 아노 펠 레스 gambiae doi: 10.3791/1725 Published: February 17, 2010

Summary

odorants에 후각 감각 뉴런의 Electrophysiological 반응은 단일 sensillum 레코딩을 사용하는 곤충에서 측정할 수 있습니다. 이 비디오를 문서에서 우리는 식초 파리의 안테나에서 단일 sensillum 레코딩을 수행하는 방법을 보여줍니다 것입니다 (

Abstract

냄새의 감각은 음식, 짝을, 육식 동물, 그리고 산란 사이트 3 찾을 수 곤충을 위해 필수적입니다. 곤충 후각 감각 뉴런은 (OSNs) 후각 기관의 표면을 커버 sensilla라는 감각 머리카락에 동봉됩니다. 각 sensillum의 표면은이를 통해 odorants 통과하고 주어진 sensillum 안에 보관되어 OSNs의 감각 dendrites을 bathes sensillum 림프라는 액체에 용해, 작은 모공으로 덮여있다. OSN의 dendrites은 odorant 수용체 (또는) 단백질을 표현, 어떤 냄새 게이 티드 이온 채널 4, 5와 같은 곤충 기능 인치 ORs 중 증가와 함께 odorants의 상호 작용 또는 OSN의 기초 발사 속도를 감소시킵니다. 행동 잠재력의 형태로의 연결이 활동은 품질, 강도, 그리고 odorant 6, 7의 시간적 특성의 첫 표현을 구체화.

이러한 감각 머리카락에 쉽게 접근할 수 감안할 때, 그것은 참조 전극은 곤충의 눈 또는 인체의 림프에 배치하는 동안, sensillum 림프에 기록 전극을 도입하여 단일 OSNs에서 세포외 녹음을 수행할 수 있습니다. Drosophila, 하나, 넷 OSNs 사이 sensilla 집에 있지만, 각 OSN은 일반적으로 특성 스파이크 진폭을 표시합니다. 스파이크 정렬 기법은 개별 OSNs로 급상승 답변을 할당하는 것이 가능합니다. 이 단일 sensillum 기록 (SSR) 기술은 sensillum 림프와 OSNs 1, 2, 8 수용체의 활동에 의해 생성되는 전기 스파이크로 참조 전극 사이의 전위의 차이를 모니터링합니다. odorant에 대응 스파이크의 숫자의 변화는 곤충의 코딩 냄새의 세포 기초를 나타냅니다. 여기서 우리는 현재 Drosophila melanogaster와 아노 펠 레스 gambiae에서 SSR을 수행하기 위해 우리가 실험실에서 사용되는 준비 방법을 설명하고, sensillum 특정 방식으로 odorants에 의해 유도 대표 흔적을 보여줍니다.

Protocol

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1. 악취 dilutions

  1. 대부분의 odorants는 파라핀 기름에 용해됩니다. 그러나, DMSO 또는 에탄올은 또한 특정 냄새에 대한 대체 용매로 사용할 수 있습니다. 유리 튜브의 순수한 odorants에서 :; 적절한 dilutions을 (V V 볼륨 예 1시 10분 볼륨) 준비합니다. 대부분의 악취 dilutions는 상온에서 안정하지만, 매우 휘발성 화합물에 대한 그것은 주간 단위로 작업 dilutions을하는 것이 좋습니다. 각 sensillum 다른 농도 범위 내에서 서로 다른 냄새에 응답합니다. Drosophila에 대한 유용한 룩업 테이블에 대해 주어진 sensillum와 함께 사용하기위한 적절한 농도는 6, 7에서 찾을 수 있습니다.

    Drosophila과 아노 펠 레스에 대한 (파라핀 오일에 V 10 -7 V) 1 - octen - 3 - OL : 비디오 실험을 위해, 우리는 용매 컨트롤과 메틸 아세테이트로 파라핀 오일을 사용 (파라핀 오일에 V 10 -6 V) 각각 기록.
  2. 가위를 사용하여, 그들은 파스퇴르 pipettes 안에 들어갈 것이라는 X 5cm 스트립 있도록 3mm로 크로마 토그래피 종이를 잘라.
  3. 피펫 30 필터 종이 스트립에 원하는 악취의 μL 및 유리 피펫에를 삽입합니다. 컷 ~ 3 공기 라인 튜브의 cm와 커넥터로 마감 피펫의 오픈 엔드에를 삽입합니다. 커넥터는이 실험 중에 냄새를 전달하는 시간이되면 다음 공기 펌프의 공기 라인 튜브에 첨부됩니다 피펫을 봉인하는 데 사용됩니다.

2. 냄새 전달 시스템

  1. 작은 드릴을 사용하여, 10 ML 플라스틱 serological 피펫을 (4 ML 마르크시 예) 잘라 냄새가 포함된 pipettes를 개최하는 데 사용됩니다 구멍 (예 : -1.5 ML 및 -0.5 ML 마르크에서) 만들 수 있습니다. 가시 커플러에 200 μL 피펫 팁을 삽입하고 10 ML 피펫의 뭉툭한 끝에 커플러를 소개합니다. 피펫은 odorants를위한 전달 시스템의 일부로 사용됩니다.
  2. 피펫 클램프와 자기 증언대에 피펫을 첨부하여 현미경 근처에 위치.

3. 선명 전극

  1. 전극을 선명하게하려면, 수산화 칼륨의 0.5 M 솔루션 (코)을 준비하고 미세 입자를 (예 : 45 μm의 필터를 사용) 제거를 필터링합니다. 20 ML의 주사기를 가지고 팁 전선이 삽입되는로 (팁부터 ~ 1 ㎝), (그림 1A).로 벽에 가까이에 바늘을 사용하여 작은 구멍을 (~ 2mm 직경) 확인
  2. 0.5 M 코와 주사기를 기입하고, 끝에이보기의 필드 (그림 1B, C)에 배치되도록 현미경 스탠드에 클램프. 와이어가 주사기의 입구 바로 앞에 있지 않은지 만들기, 주사기 벽 (그림 1B)에있는 작은 구멍에 전선을 삽입합니다. DC 전원 공급 장치 (예 : 와일드 Heerbrugg MTR32, 방법 참조) 또는 AC 전원 공급 장치 (예 : 와일드 Heerbrugg - LEP 990018)의 기둥의 음극이 전선을 연결합니다. 현미경의 오른쪽에있는 매뉴얼 micromanipulator에 전극 홀더 샤프트를 첨부하고, 악어 클립으로 전극 홀더 샤프트의 기지에서 전기 케이블을 연결합니다. DC 전원 공급 장치 또는 AC 전원 공급 장치 (그림 1A)의 다른 극의 양극에 케이블을 연결합니다.
  3. 전극 홀더에 텅스텐 와이어를 (~ 5cm의 길이)를 삽입하고, 조작하는 사람에 전극 홀더 샤프트에 첨부해 주시기 바랍니다. 6 V의 전원 공급 장치를 설정하고, 프로세스 (그림 1C) 동안 현미경 팁을 모니터 신중하고 그것을 연마하기 위해 반복 주사기로 와이어의 끝부분을 삽입합니다. 레코딩을위한 이상적인 전극을 얻으려면, 최대 1 분 수있는 솔루션의 길이의 90 %를 배치하고, 그것을 천천히 빼낸다. 다음 30 s에 대한 더 얇게하는 ~은 전극의 50 %를 삽입하고, (~ 10 배) 날카롭게 와이어의 팁을 얻을 그것을 반복합니다.

    전극의 끝은 레코딩 (6 단계와 7 단계)하는 동안 그것을 닿을 때 구부만큼 괜찮아요 sensillum에 들어갈 정도로 괜찮지만,해야합니다. 가 날카롭게하는 동안 해부 현미경 전극 팁을 시청하는 것은 주어진 전극 녹음에 적합한지 여부 명확한 아이디어를 줄 것이다에만 높은 배율에서 촬영 현미경으로보고, 그 두께의 좋은 표시이지만.

4. 곤충 준비 : Drosophila 안테나

  1. 플라이 흡인기를 작성할 수 있습니다. 충분히 (- 120cm 약 90) 당신의 목에 편안하게 걸어 공기 라인 튜브의 한 조각을 잘라 버릴거야. 200 μL 피펫 팁의 끝부분을 잘라와 튜브의 한쪽 끝을로를 삽입합니다. 다른 쪽 끝을, 위치 ~ 1.5 cm X 그것이 물리적인 장벽을 만들지만 튜브 흐르​​는에서 공기를 방지하지 않도록 메쉬 1.5 cm 기사. 사이에 메쉬를 차단하고, 튜브 여는 위에 1 ML의 피펫 팁 및 위치 넓은 엔드의 끝을 잘라. 이 부분은 픽업 및 성인 식초 빠르다 (그림 2)를 조작하는 데 사용됩니다.
  2. 현미경 슬라이드를 타고 약 긴 쪽의 한가운데에 치과 왁스 조각을 넣으십시오. 그것 positio 위에유리 커버 나 것은 약간 왁스 직접 현미경으로 식초 파리의 시각화를 방지 것이 맨 위에 부분, 아래에 있지 않은지 확인하고, 위쪽 (~ 30) 기울어져. 수직 풀러와 유리 전극을 당기세요. 그 끝이 얇고 두 번째 및 세 번째 antennal 세그먼트 사이에 들어갈 정도로 융통성과 레코딩을위한 안테나를 안정해야합니다. 왁스의 다른 조각에있는 유리 전극을 위치와 멀리 끝이 저하되었을 때 그것이 커버 유리 (그림 3A)의 구석에 도달 즉, 커버 유리의 측면에 배치하십시오.
  3. 원하는 유전자형의 파리 성충의 병이나 유리병에서 일하고, 파리 흡인기를 사용하여 성인 식초 플라이를 선택하십시오. 여성은 일반적으로하기 때문에 그들의 큰 크기의 사용이지만, 남성도 사용하실 수 있습니다. 이스케이프의 비행을 피하기 위해 한 ML 팁 위에 200 μL 피펫 팁 놓으십시오. 비행이 200 μL 피펫 팁의 끝 부분을 향해 밀려되도록, 튜브에 불어. 몇 밀리미터 떨어진 비행 자체에서 면도날과 피펫 팁의 넓은 끝을 장식하고 밖으로 백업에서 비행을 방지하기 위해 어떤 왁스를 삽입합니다. 현미경, 동물을 손상하지 않도록주의를 기울이고, 식초 파리의 머리 근처에 다시 했네요. 작은 피펫 팁을 통해 눈 약 절반 팁 (그림 3B)에서 돌출되도록 파리 머리를 밖으로 강제로 왁스를 누르십시오. 그 다리뿐만 아니라 나와 없거나 그들은 레코딩과 이동 방해 수 있는지 확인하십시오.
  4. , 왁스의 조각에 파리를 마운트의 머리가 위쪽을 향하도록하고 덮개 유리 앞 슬라이드에 배치하십시오. 안테나가 연장 및 유리 나머지 있도록 유리의 모서리에 대해 약간 머리를 밀어. 두 번째 및 세 번째 antennal 세그먼트 (그림 3B) 사이에 모세관 유리의 팁을 낮춥니다.
  5. 안테나의 여러 부분이 서로 다른 sensilla 유형에 대한 액세스를 제공합니다. 특히 실험 필요에 따라 안테나 다른 sensilla 유형에 대한 액세스를 허용하도록 다른 방향해야합니다. 우리의 예제와 같이 큰 basiconic sensilla에서 녹음하려면, 아리 스타가 유리 (그림 3B)에 아래로 밀고있다.

5. 곤충 준비 : 아노 펠 레스 상악 palps

  1. 전기 흡인기 (그림 2E)를 사용하여 작은 플라스틱 케이지 (그림 2 층)에 40-60 3~5일 오래된 모기 (혼합 남성 및 여성)를 수집합니다. 모기는 25-28에서 곤충 배양기 또는 insectary에서 즉, 정상적인 조건 하에서 reared 했어야 ° C가 70-80% 습도와 함께. 그들은 추위에 의해 anesthetized 때까지 ~ 15 분 얼음 동물과 작은 플라스틱 케이지를 놓습니다. 동물이 움직이는 중단되면, 절차 동안 얼음 동물의 나머지 부분을 유지 한 번에 현미경 무대에만 4-6 동물을 전송합니다. 여성은 대개 CO 2 자신의 감성 사용할 수 있지만, 남성도 고용 수 있습니다. 그들의 안테나의 구조 (필라멘트와 같은 남성의 여성에 깃털 같은)에 의해 심사, 여성 또는 남성 모기를 선택하고 그들을 무력화하기 위해 미세 포셉 그들의 날개와 다리를 제거합니다. 그들은 건조한 방지하기 위해, 아래에 젖은 종이 작은 플라스틱 컵에 보관하십시오.
  2. 중앙 및 슬라이드 유리의 측면에서 (~ 1cm 간격)를 서로 평행 양면 테이프 두 조각 (길이 ~ 1 ㎝), (그림 3C)을 넣어. 고급 집게를 사용하여 해부 현미경으로 중앙 테이프 한 모기를 배치하고, 옆으로 돌려 및 테이프에의 몸을 한 눈을 스틱. 두 palps이 테이프 (그림 3D)에 병렬로 확장할 수 있도록 턱의 palps의 위치를​​ 조정합니다. 기지에서, palps (그림 3D)의 끝에 모두 얇은 문자열 (예 : 인간의 머리카락)을 배치하여 상악 palps을 수정. 중앙 테이프가 모든 기록 (그림 3C) 이후 교체해야 동시에 사이드 테이프는 얇은 문자열의 저장소로 사용됩니다.

6. 녹음 Drosophila melanogaster

  1. 낮은 배율과 약 전망 (FOV) (그림 4B)의 필드의 중앙에 위치 안테나에서 현미경 (그림 4A) 아래에있는 슬라이드를 놓습니다. 부드럽게 참조 전극이 비행과 기록 전극이 안테나 근처에있다 (그림 4C)의 눈 부근 있도록 전극을 낮추십시오. FOV (그림 4D)의 중간에 배율 다시 위치 안테나를 높이십시오.
  2. 안테나를 겨누고, 비행의 머리에 냄새 전달 장치 가까이를 놓습니다.
  3. 낮은 배율 (그림 4C)에서 비행의 눈으로 참조 전극을 삽입합니다. 그 표면을 건드리지 않고 안테나의 상단에 기록 전극을 낮추십시오.
  4. 높은 배율로 전환, micromanipulator과 기록 전극을 제어하고 선택 sensillum (그림 4D)에 그것을 삽입합니다. sensillum의 길이를 따라 모든 포인트는 기록하는 것이 좋습니다. 일단 sensillum 내부의 전극에 더 밀어 수있는 (때로는 모든 방법을 통해)노이즈 비율 더 나은 신호를 얻을 수 있습니다. 전극이 sensillum에되면, 세포의 자발적인 활동이 감지 수 있습니다.

7. 녹음 아노 펠 레스 gambiae

  1. 낮은 배율 (10X)와 대략 FOV 및 상단에있는 머리의 중앙에 위치 상악의 palps을에서 현미경 유리 슬라이드 플레이스 (그림 4E). palps 중 하나가 기록 전극과 직각으로까지 무대를 회전합니다.
  2. 참조 전극 그냥 모기와 기록 전극은 상악 palps 근처의 눈 위에 위치되도록 전극의 높이를 조정합니다.
  3. 그것이 가까이 palps에 가능한되도록 악취 전달 장치를 놓습니다.
  4. 낮은 배율 (10X)에서 눈 안으로 참조 전극을 삽입하고, 높은 배율 (100x)로 전환, 촉수 (그림 4 층)에있는 말뚝 sensillum에 기록 전극을 삽입합니다. 전극이 sensillum에되면, 세포의 자발적인 활동이 감지 수 있습니다.

8. 대표 결과

sensillum과 녹음의 품질에 따라 하나 하나 추적 이내 후각 뉴런의 다른 번호를 구분할 수 있습니다. Drosophila melanogaster의 대형 basiconic sensilla에서, 예를 들어, 스파이크 진폭의 차이가 2 사이 4 세포 녹음이 9, 10 중에 나타납니다.

우리의 비디오 실험에서 Drosophila ab2 sensillum 두 세포, 세포 (그림 5 번, 청색 스파이크) 및 B 세포 (그림 5, 녹색 스파이크).을 보여줍니다 오직 세포 메틸 아세테이트의 10 -6 희석 (그림 5B)에 대응하는 동안 어느 세포는 파라핀 오일 (그림 5A)의 응용 동안 활성화됩니다.

아노 펠 레스 gambiae의 상악 촉수에서 홈 붙이 말뚝 sensillum 세 세포를 포함하고 있지만, 두 쉽게 (각각 그림 5C, 파란색과 녹색 스파이크) 차별하고 있습니다. 비디오 실험에서 우리는 B 세포는 (그림 5D) 1 octen - 3 - 올의 10 -7 희석에 응답하는 방법을 보여줍니다.

그림 1
그림 1. 전극 숫돌
전극 깎이 장치의 (A) 일반 참조하십시오. (B) 주사기의 개통 옆에있는 전극 팁의 (C) 닫기 접속 전극 (오른쪽) 선명하게하는 데 사용되는 0.5 M 코를 (왼쪽). 포함된 주사기.

그림 2
그림 2. 플라이 흡인기와 모기의 흡인기를 준비하는 방법
(A) 소재 시작 :... 공기 라인 플라스틱 튜브, 두 컷 피펫 팁, 그리고 메쉬를 (B) 플라이 흡인기가 완료되면 (C) 식초 마리 정도씩 잡아 먹습하는 데 사용되는 최종의 상세 (D) 상세 파리 흡인기의 다른 끝. (E) 모기 컬렉션 전기 흡인기는 본체와 분리 가능한 플라스틱 케이지로 구성되어 있습니다. 모기에 대한 (F) 분리형 플라스틱 케이지입니다.

그림 3
그림 3. 녹음을위한 식초 파리 (Drosophila melanogaster)와 말라리아 모기 (아노 펠 레스 gambiae)를 준비
(A) 식초의 그림은 현미경으로 그것을 위치하기 전에 슬라이드에 장착 비행을하세요. (B) 모세관 유리의 장소에 보관 안테나와 식초 파리 헤드 - 업 닫습니다. (C) 모기의 그림에 장착된 슬라이드. (D) 클로즈업 테이프에서 튀어나와 코와 palps로 모기 머리.

그림 4
그림 4. 식초 파리 (Drosophila melanogaster)와 말라리아 모기 (아노 펠 레스 gambiae)에서 레코딩
(A) 전기 생리학 설정을 참조하십시오. (B) 근접 비행 준비는 현미경에 장착. 플라이 안테나의 기록 전극 (왼쪽), 악취 전달 시스템 (중간 피펫) 및 기록 전극 (오른쪽)의 각 위치를 확인할 수 있습니다. (C) 10X 목표 아래 날아 이미지. (D) 이미지 아래 100x 목표,. 녹음 탑재 모기가 아닌 감각 머리카락 (화살촉) 사이에 interspersed 큰 basiconic sensilla는 (화살표), (E) 10X 볼 모기 촉수와 말뚝 sensillum (화살표)의 (F) 높은 배율 볼 수 있습니다. .

그림 5
그림 5. Drosophila melanogaster에서 레코딩의 예과아노 펠 레스 gambiae
(A) Drosophila melanogaster의 ab2의 sensillum 두 감각 뉴런 주택,.. 세포 (파란색 스파이크)와 B 세포 (녹색 스파이크)를 (B) 10 -6 메틸 아세테이트의 응용 프로그램을하는 동안 A와 B 세포 (C) 세포 (파란색 스파이크)와 B 세포 (녹색 스파이크) 10 -7 말뚝 sensillum 1 - octen - 3 - 올의 (D) 지원;. 아노 펠 레스 gambiae의 말뚝 sensillum 두 감각 뉴런을 전시하고 있습니다.

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Discussion

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후각 단서는 음식 소스, 잠재적인 친구, 그리고 포식자을 식별하는 생물에 의해 사용됩니다. 후각 감각 뉴런 (OSNs)은 외부 자극과 정보가 추가로 처리하는 두뇌의 높은 중심 사이의 첫 번째 릴레이 센터됩니다. Drosophila melanogaster와 아노 펠 레스 gambiae에서 OSNs에 쉽게 액세스할 수 있으며 악취 퍼프에 의해 자극을 동시에 전기적 활동은 모니터링할 수 있습니다.

단일 sensillum 기록 (SSR) 기술이 널리 OSNs에서 기록하고 odorants 6, 7의 많은 자신의 전기 반응을 연구하는 데 사용되었습니다이 동영상에 설명했다. 후각 수용체 (ORs) 6, 11, Drosophila 안테나 9, 12, 13에서 특정 위치로 ORs의 매핑의 deorphanization은 최초로, SSR 기술에게 생체내 특정 ORs의 electrophysiological 속성을 분석하는 강력한 도구를 만들었습니다 외부 후각 세상의 OSNs을 통해 전기 신호로 번역하고 결국 동물로 인식하는 방법 이해하는 단계.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Paraffin oil Odors Fluka 76235
High purity odors (>98%) Odors Sigma-Aldrich Methyl acetate
#296996
1-octen-3-ol
#74950
Filter paper strips Odors Fisher Scientific 05-714-1 Chromatography paper
Connectors Odors Cole-Parmer EW-06365-40 1/16x1/8"
Glass vials Odors Agilent Technologies 5182-0556
Air line plastic tubing Odor Delivery Python Products 500PAL
1 serological pipette Odor Delivery Corning 4101 10 mL
Plastic tubing Odor Delivery Cole-Parmer EW-06418-0 0.050"x0.090"OD
Disposable borosilicate glass Pasteur pipettes Odor Delivery Fisher Scientific 13-678-20A 5-3/4 inches
Programmable stimulus controller Odor Delivery Syntech CS-55
Anti-vibration table Electrophysiology Equipment TMC 63533 36”Wx30”Dx29”H
Faraday cage Electrophysiology Equipment TMC MI8133303
Inverted microscope Electrophysiology Equipment Nikon Instruments E600FN ECLIPSE Recording microscope
10x and 100x objectives Electrophysiology Equipment Nikon Instruments 10x Plan Fluor 100x L Plan
Dissecting microscope Electrophysiology Equipment Nikon Instruments EZ645 electrode sharpening/insect prep microscope
Magnetic stands Electrophysiology Equipment Newport Corp. MODEL 150
IDAC Electrophysiology Equipment Syntech IDAC-4
Acquisition software Electrophysiology Equipment Syntech Autospike
1 macromanipulator Electrophysiology Equipment Narishige International MN-151 Joystick manipulator
Used for positioning reference electrode
1 micromanipulator Electrophysiology Equipment EXFO PCS-6000 Used for positioning recording electrode
Crocodile clip Electrophysiology Equipment Pomona AL-B-12-0
Electric cable Electrophysiology Equipment Pomona B-36-0 Test Cable Assembly
2 electrode holders Electrophysiology Equipment Syntech N/A Electrode holders (set of 2) for tungsten wire electrode
AC probe Electrophysiology Equipment Syntech N/A Universal single ended probe (10xAC)
Tungsten electrodes Electrophysiology Equipment Microprobes M210 straight tungsten rods, 0.005x3
Potassium hydroxide Electrophysiology Equipment Sigma-Aldrich 221473
Syringe Electrophysiology Equipment BD Biosciences 301625 20 mL
Power supply Electrophysiology Equipment Wild Heerbrugg e.g MTR32
Vertical puller Insect prep Narishige International PB-7
Razor blade Insect prep VWR international 55411-050
Dental wax Insect prep Patterson 091-1503
Microscope slide Insect prep Fisher Scientific 12-550A
Cover glass Insect prep Fisher Scientific 12-541A 18X18 #1.5
Polypropylene mesh Insect prep Small Parts, Inc. CMP-0500-B
Glass electrode Insect prep Frederick Haer and Co. 27-32-0-075 Capillary tubing borosilicate 1.5mm OD x 1.12mm ID x 75 mm
Double-sided tape (3M) Insect prep 3M MMM6652P3436 Double-sided tape (3M)
Forceps Insect prep Fine Science Tools 021x0053 Dumont #5 Mirror Finish Forceps
Small plastic cup Insect prep VWR international 89009-662 7 x 5.7 (23/4 x 21/4)
Electric aspirator Insect prep Gempler’s RHM200

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References

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곤충의 단일 Sensillum 레코딩<em> Drosophila melanogaster</em>과<em> 아노 펠 레스 gambiae</em
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Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (36), e1725, doi:10.3791/1725 (2010).More

Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (36), e1725, doi:10.3791/1725 (2010).

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