Summary
在使用单一感器录音昆虫气味的嗅觉感官神经元的电生理反应，可测。在这个视频文章，我们将演示如何执行单一飞醋的触角感器录音（。
Abstract
昆虫的嗅觉寻找食物，配偶，天敌和产卵场所3，。昆虫的嗅觉感觉神经元（OSNs）被称为感受器的感觉毛，其中包括嗅觉器官表面封闭。每个感器的表面覆盖着微小的孔隙，通过气味传递和化解感器淋巴液的液体，沐浴安置在一个给定的感器OSNs的感官树突。通过OSN树突表达气味受体（OR）的蛋白质，它在昆虫气味门控离子通道4，5的功能。互动的ORs要么增加气味或减少通过OSN基础射速。这在动作电位形成的神经元活动体现的质量，强度和时间特征的气味6，7的第一个代表性。
鉴于方便地访问这些感觉毛，它可以执行从单一OSNs引入感器淋巴结记录电极，参比电极放置在昆虫的眼睛或身体的淋巴结外的录音。在果蝇 ，一至四个OSNs感器的房子，但每个OSN通常会显示一个特征的尖峰幅度。穗排序技术使人们有可能分配扣球个别OSNs的反应。这种单一感器记录（SSR）技术监控潜在OSNs 1，2，8受体活性产生的尖峰电脉冲感器淋巴液和参比电极之间的区别。在尖峰数量变化的气味代表的气味编码在昆虫细胞的基础。这里，我们描述的制备方法，目前在我们的实验室用来执行对果蝇和按蚊的SSR，并显示在感器特定方式的气味引起的代表痕迹。
Protocol
1。气味稀释
- 大多数气味溶于石蜡油。然而，DMSO或乙醇也可以被用来作为对特定气味的替代溶剂。准备适当稀释（例如1:10体积：体积，V：V）从纯粹的玻璃小瓶气味。大多数的气味稀释，在室温下稳定，但极易挥发的化合物，它是更好的每周工作稀释。每个感器的响应，以不同浓度范围内不同的气味。对于果蝇 ，一个有用的查表的，适当的浓度，使用一个给定的感器，可以发现在6，7。
对于视频实验中，我们用石蜡油作为溶剂的控制和醋酸甲酯（10 -6 V：v在石蜡油）和1 -辛烯-3 - 醇 （10-7 V：v在石蜡油）对果蝇和按蚊录音，分别为。 - 用剪刀，切成3毫米× 5厘米条层析纸，使他们适合巴斯德吸液管内。
- 移液器30μL的滤纸条上所需的气味，玻璃吸管插入。切〜3厘米的空气管路，插入吸管的开口端，关闭它的连接器。连接器是用来密封吸管，然后将连接到一个空气泵空气管路时，时间，在实验过程中提供的气味。
2。气味输送系统
- 使用的小钻，切10毫升塑料血清移液器（如在4毫升），并创建两个孔（例如，在-1.5 mL和-0.5毫升商标）将用来存放移液器含有的气味。插入一个200μL枪头刺耦合，并引入到10毫升吸管的钝端的耦合。吸管将被用作气味交付系统的一部分。
- 附加磁性支架上的吸管，用吸管钳和附近的显微镜，它的位置。
3。锐化电极
- 为了加强电极，准备0.5米的氢氧化钾溶液（KOH）和过滤器以去除细颗粒物（如：采用45微米过滤器）。 20毫升的注射器和一个小孔（直径为2毫米），墙上贴着一针针尖（从尖〜1厘米），在其中插入电线（图1A）。
- 填充注射器，用0.5 M KOH和打击，在显微镜下它的立场上，使针尖放置在视野（图1B，C），。到注射器上墙（图1B）的小孔，插入电线，确保导线是不能直接在注射器入口前。此线连接到直流电源（例如野生Heerbrugg MTR32，见方法）或交流电源（如野生Heerbrugg - LEP 990018）极的阴极。连接到显微镜右侧的手动显微电极支架轴，并附加电缆与鳄鱼夹的电极支架轴的基础。连接电缆的直流电源或交流电源（图1A）的另一极阳极。
- 插入电极支架的钨丝（约5厘米长），并且将它附加到电极支架轴操纵。设置为6 V的电源，插入注射器反复磨练线的一角，小心监控，在显微镜下在这个过程中的提示（图1C）。要得到一个理想的录音的电极，其长度在溶液中的90％，为1分钟，并慢慢地将其拉出。然后插入只有约50％的电极，以进一步薄30秒，并重复削尖（〜10倍）的导线尖端。
电极尖端应足够细，进入了感器，但没有这么细，弯曲，当它触动它在录音（步骤6和7）。虽然看解剖显微镜下的电极尖端，而它被削尖，是一个很好的迹象，其厚度仅看它记录在高倍显微镜下将给出一个明确的想法，一个给定的电极是否适合用于记录。
4。昆虫准备： 果蝇天线
- 构建一只苍蝇抽吸。剪下一块空气管路足够长的时间挂在你的脖子，舒适（约90 - 120厘米）。剪下200μL枪头的尖端和管的一端插入。在另一端，位置1〜1.5厘米× 1.5厘米的网状片，以便它创建了一个物理屏障，但并不妨碍空气管流出。剪下1毫升枪头和管开放的顶部位置更广泛的提示，阻断之间的网格。这部分将用于拿起和操纵成人醋蝇（图2）。
- 以载玻片，放置了一块大约在长边的中间牙科用蜡。它positio顶部NA玻璃盖略微倾斜向上（〜30），确保蜡是不是直接放在最上面的一部分，这将防止在显微镜下可视化飞醋。拉玻璃电极垂直拉拔。其尖端应薄且具有足够的灵活性，以适应在第二和第三的触角段之间，并保持录音天线稳定。另一块蜡玻璃电极的位置，放在玻璃盖的一侧，远远不够，笔尖的时候，降低到达角落的玻璃盖（图3A）。
- 工作所需的基因型成蝇瓶或小瓶，拿起一个成年人的飞醋，使用飞抽吸。虽然女性通常是因为他们的更大的大小，男性也可以使用。 1毫升的小费上放置一个200μL枪头，以避免逃跑的飞行。吹入管，使飞对200μL枪头年底推。修剪刀片的枪头远离苍蝇本身几毫米宽的一端，然后插入一些蜡，以防止飞打了退堂鼓。在显微镜下，再次下调头附近的飞醋，注意不损害动物。有了一个小吸头，推蜡力飞头，使眼睛的一半左右，从尖（图3B）挤出。确保它的腿不出来为好，否则可能会移动和干扰录音。
- 山飞一块蜡，其头部朝上，并将其放置在前面的玻璃盖的幻灯片上。将头微微对玻璃的一角，使触角延伸和休息上的玻璃。下之间的第二次和第三次的触角段（图3B）的玻璃毛细管的尖端。
- 天线的不同部分会进入到不同类型的感受器。根据特定的实验需要，天线将需要面向不同的，允许访问到不同类型的感受器。要记录在我们的例子从大basiconic感器的阿里斯塔向下压在玻璃上（图3B）。
5。昆虫准备： 按蚊上颌触须
- 使用电动吸引器（图2E），40至60 3-5天（混合男性和女性）老蚊子收集的小塑料箱（图2F）。蚊子应该已经在正常条件下饲养，在昆虫的孵化器或insectary即在25-28℃，湿度70-80％。将冰〜15分钟的小动物的塑料保持架，直到它们被寒冷的麻醉。动物一旦停止移动，只有4-6动物转移的阶段，在显微镜下在任何一个时间内，保持其余的动物，在程序上冰。虽然女性通常是因为他们对CO 2的敏感性，男性也可聘用。选择女性或男性的蚊子，其天线结构（羽毛般的女性，男性长丝）来看，并删除它们的翅膀和腿，用细镊子固定。保持在一个小塑料杯，他们在底部的湿纸，以防止他们从desiccating。
- 把两条双面胶带（〜1厘米的长度），在该中心，并在载玻片两侧平行于对方（〜1厘米），（图3C）。用细镊子，地方对中央磁带之一蚊子解剖显微镜下，侧身把它坚持它的身体和一只眼睛，在磁带上。调整这样既触须延伸到磁带上（图3D）平行的位置上颌骨的触须。弦细（如人的头发）放置在基地和触须（图3D）的尖端修复上颌骨的触须。端磁带存储作为弦细，而中央的磁带需要被替换后，每一个记录（图3C）。
6。记录果蝇
- 幻灯片下放置在低倍率的显微镜和天线位置大致在中间领域的视野（FOV）（图4B）（图4A）。轻轻放下，使参比电极电极位于飞和记录电极靠近天线（图4C）眼睛附近。增加在中间的视野（图4D）的放大倍率和重新定位的天线。
- 广场的气味传递给设备密切飞的头，指着在天线。
- 在低倍率（图4C），参比电极插入飞的眼睛。下而不触及其表面上的天线顶端的记录电极。
- 切换到高放大倍率，控制与显微记录电极，并把它插入到选定感器（图4D）。沿感器长度的任何一点是录制好的。一旦感器内，电极可推更远（有时所有的方式通过）以获得更好的信噪比。一旦电极感器，可以检测细胞的自发活动。
7。录音按蚊
- 放置在低倍率（10倍）的视野和头顶部的中间位置，大约在上颌骨的触须的显微镜下的载玻片（图4E）。旋转舞台，直到在直角与记录电极的触须。
- 调整电极的高度，使参比电极定位略高于眼睛的蚊子和记录电极附近的上颌骨的触须。
- 将气味传送装置，使其尽可能接近的触须。
- 参比电极插入眼睛，在较低的放大倍率（10倍），并切换到更高的放大倍率（100X），触须（图4F）的记录电极插入PEG感器。一旦电极感器，可以检测细胞的自发活动。
8。代表性的成果
根据感器和录音质量，可以区分不同数量的嗅觉神经元在一个单一的跟踪。 果蝇在大basiconic感器，例如，2至4尖峰幅度不同的细胞应该会出现在录制过程中，10 。
我们的视频实验中，果蝇AB2感器显示两个细胞，一个细胞（图5，蓝色的尖峰）和B细胞（图5，绿色尖峰） 。石蜡油（图5A）申请的过程中无论是细胞被激活，而只有在一个细胞响应10-6稀释醋酸甲酯（图5B ）。
在按蚊的上颌触须，沟槽PEG感器包含三个单元格，但只有两个很容易受到歧视（图5C，蓝色和绿色的峰值，分别）。在视频实验中，我们显示的B细胞如何响应一个10-7稀释1 -辛烯-3 -醇（图5D ）。
图1。电极卷笔刀
（二）（A）一般查看电极机设备。的注射器，注射器开幕电极尖端含有0.5 M KOH（左）用于增强电极（右）。（c）关闭。
图2。如何准备飞抽吸和蚊子吸气泵
（A）启动材料：。。空气线塑料管，两个切割枪头，和网状（二）（四）一旦完成飞抽吸（三）年底，是用来捕捉醋蝇的详细细节飞抽吸另一端（E）电动吸引蚊子收集由一个主体和一个可拆卸的塑料保持架（F）可拆卸的蚊子塑料保持架。
图3。准备录制一个飞醋（ 果蝇 ）和疟疾的蚊子（ 按蚊 ）
（二）（一）飞行装醋的图片前，它定位在显微镜下幻灯片上。特写玻璃毛细管保持在天线的飞醋头（C）一种通过蚊子传播的图片上安装幻灯片（d）关闭蚊子头长鼻和磁带上的触须坚持。
图4。录制从飞醋（ 果蝇 ）和疟疾的蚊子（ 按蚊 ）
（一）电设置（B）的飞行准备关闭安装在显微镜上。请注意各自的位置，记录电极（左），气味传送系统（中间移液器），和记录电极（右）（C）下10倍的目标动态图像（D）飞天线100X的目标;大basiconic感器（箭头），（五）非感官毛（箭头）之间穿插的10X查看记录安装一只蚊子（F）的蚊子的触须和PEG感器（箭头）高倍镜视野。 。
图5。从果蝇的录音和按蚊
（一） 果蝇的AB2感器房子两个感觉神经元;。一个单元格（蓝色尖峰）和B细胞（绿色尖峰）（二 ）10-6醋酸甲酯的应用过程中的A和B 细胞 （C） PEG 按蚊感器设有两个感觉神经元的一个单元格（蓝色尖峰）和B细胞（绿色尖峰）（四）10-7 1 -辛烯-3 -醇PEG感器的应用。
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Discussion
用于生物识别的食物来源，潜在的队友，和食肉动物的嗅觉线索。嗅觉感觉神经元（OSNs）之间的外部刺激，并进一步处理信息的大脑中心的第一个接力中心。在果蝇和按蚊 ，OSNs方便，可以监视他们的电活动而刺激的气味喷。
单感器记录（SSR）技术的解释，该视频已被广泛应用于从OSNs记录和研究它们的电反应，大量的气味6， 7。嗅觉受体（ORS）6，11和口服补液盐映射到特定地点的果蝇天线9，12，13 deorphanization的SSR技术分析体内特定的ORs的电生理特性的有力工具，作为第一个一步了解了外部嗅觉世界是如何翻译成电信号通过其OSNs，并最终被动物感知。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin oil | Odors | Fluka | 76235 | |
| High purity odors (>98%) | Odors | Sigma-Aldrich | Methyl acetate #296996 1-octen-3-ol #74950 |
|
| Filter paper strips | Odors | Fisher Scientific | 05-714-1 | Chromatography paper |
| Connectors | Odors | Cole-Parmer | EW-06365-40 | 1/16x1/8" |
| Glass vials | Odors | Agilent Technologies | 5182-0556 | |
| Air line plastic tubing | Odor Delivery | Python Products | 500PAL | |
| 1 serological pipette | Odor Delivery | Corning | 4101 | 10 mL |
| Plastic tubing | Odor Delivery | Cole-Parmer | EW-06418-0 | 0.050"x0.090"OD |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipettes | Odor Delivery | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5-3/4 inches |
| Programmable stimulus controller | Odor Delivery | Syntech | CS-55 | |
| Anti-vibration table | Electrophysiology Equipment | TMC | 63533 | 36”Wx30”Dx29”H |
| Faraday cage | Electrophysiology Equipment | TMC | MI8133303 | |
| Inverted microscope | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | E600FN ECLIPSE | Recording microscope |
| 10x and 100x objectives | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | 10x Plan Fluor 100x L Plan | |
| Dissecting microscope | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | EZ645 | electrode sharpening/insect prep microscope |
| Magnetic stands | Electrophysiology Equipment | Newport Corp. | MODEL 150 | |
| IDAC | Electrophysiology Equipment | Syntech | IDAC-4 | |
| Acquisition software | Electrophysiology Equipment | Syntech | Autospike | |
| 1 macromanipulator | Electrophysiology Equipment | Narishige International | MN-151 | Joystick manipulator Used for positioning reference electrode |
| 1 micromanipulator | Electrophysiology Equipment | EXFO | PCS-6000 | Used for positioning recording electrode |
| Crocodile clip | Electrophysiology Equipment | Pomona | AL-B-12-0 | |
| Electric cable | Electrophysiology Equipment | Pomona | B-36-0 | Test Cable Assembly |
| 2 electrode holders | Electrophysiology Equipment | Syntech | N/A | Electrode holders (set of 2) for tungsten wire electrode |
| AC probe | Electrophysiology Equipment | Syntech | N/A | Universal single ended probe (10xAC) |
| Tungsten electrodes | Electrophysiology Equipment | Microprobes | M210 | straight tungsten rods, 0.005x3 |
| Potassium hydroxide | Electrophysiology Equipment | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Syringe | Electrophysiology Equipment | BD Biosciences | 301625 | 20 mL |
| Power supply | Electrophysiology Equipment | Wild Heerbrugg | e.g MTR32 | |
| Vertical puller | Insect prep | Narishige International | PB-7 | |
| Razor blade | Insect prep | VWR international | 55411-050 | |
| Dental wax | Insect prep | Patterson | 091-1503 | |
| Microscope slide | Insect prep | Fisher Scientific | 12-550A | |
| Cover glass | Insect prep | Fisher Scientific | 12-541A | 18X18 #1.5 |
| Polypropylene mesh | Insect prep | Small Parts, Inc. | CMP-0500-B | |
| Glass electrode | Insect prep | Frederick Haer and Co. | 27-32-0-075 | Capillary tubing borosilicate 1.5mm OD x 1.12mm ID x 75 mm |
| Double-sided tape (3M) | Insect prep | 3M | MMM6652P3436 | Double-sided tape (3M) |
| Forceps | Insect prep | Fine Science Tools | 021x0053 | Dumont #5 Mirror Finish Forceps |
| Small plastic cup | Insect prep | VWR international | 89009-662 | 7 x 5.7 (23/4 x 21/4) |
| Electric aspirator | Insect prep | Gempler’s | RHM200 |
References
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