Summary
Risposte elettrofisiologiche dei neuroni sensoriali olfattivi di odori può essere misurata in insetti utilizzando registrazioni sensillum singolo. In questo articolo il video ci mostrerà come eseguire registrazioni sensillum singolo nelle antenne del moscerino della frutta (
Abstract
L'olfatto è essenziale per gli insetti di trovare cibo, compagni, predatori e siti di deposizione delle uova 3. Insetti neuroni olfattivi sensoriali (OSNs) sono racchiusi in peli sensoriali chiamati sensilli, che coprono la superficie degli organi olfattivi. La superficie di ogni sensillum è coperta di minuscoli pori, attraverso i quali passano odoranti e si dissolvono in un liquido chiamato linfa sensillum, che bagna i dendriti sensoriali della OSNs ospitato in un sensillum dato. I dendriti OSN esprimere recettore odorizzante (OR) proteine, che in funzione di insetti come odore canali ionici 4, 5. L'interazione di odoranti con OR aumenta o diminuisce la velocità basale cottura della OSN. Questa attività neuronale, sotto forma di potenziali d'azione rappresenta la prima rappresentazione della qualità, intensità e caratteristiche temporali del odorizzante 6, 7.
Dato il facile accesso a questi peli sensoriali, è possibile effettuare registrazioni extracellulari da OSNs singolo con l'introduzione di un elettrodo di registrazione nella linfa sensillum, mentre l'elettrodo di riferimento si trova nella linfa degli occhi o del corpo dell'insetto. In Drosophila, sensilli casa da uno a quattro OSNs, ma ogni OSN mostra tipicamente un caratteristico picco di ampiezza. Tecniche di ordinamento Spike permettono di assegnare le risposte spiking a OSNs individuali. Questo singolo registrazione sensillum (SSR) tecnica controlla la differenza di potenziale tra la linfa sensillum e l'elettrodo di riferimento come picchi elettrici che vengono generati dall'attività recettore sulla OSNs 1, 2, 8. Cambiamenti nel numero di picchi in risposta alla odorizzante rappresentare la base cellulare di odore di codifica negli insetti. Qui, descriviamo il metodo di preparazione attualmente in uso nel nostro laboratorio per eseguire SSR sulla Drosophila melanogaster e Anopheles gambiae, e mostrano tracce di rappresentanza indotta dalla odoranti in un sensillum specifico modo.
Protocol
1. Odore diluizioni
- La maggior parte dei odoranti sono solubili in olio di paraffina. Tuttavia, DMSO o l'etanolo può essere utilizzato anche come solventi alternativi per gli odori particolari. Preparare diluizioni appropriate (ad esempio 1:10 del volume: volume, v: v) da odoranti puro in flaconcini di vetro. La maggior parte degli odori diluizioni sono stabili a temperatura ambiente, ma per i composti altamente volatili è meglio fare diluizioni di lavoro su base settimanale. Ogni sensillum risponde a diversi odori all'interno di un range di concentrazione diversa. Per Drosophila, un utile look-up table per concentrazioni adeguate per l'utilizzo con un sensillum dato può essere trovato in 6, 7.
Per l'esperimento video, usiamo l'olio di paraffina come un controllo di solvente e acetato di metile (10 -6 v: v in olio di paraffina) e 1-octen-3-olo (10 -7 v: v in olio di paraffina) per Drosophila e Anopheles registrazioni, rispettivamente. - Utilizzando le forbici, tagliare la carta cromatografia in 3 mm x 5 strisce di cm in modo che si inserisce all'interno di pipette Pasteur.
- Pipettare 30 ml di odore desiderato su una striscia di carta da filtro e inserirlo nella pipetta di vetro. Tagliare ~ 3 cm di tubo linea d'aria e inserirlo nella parte aperta della pipetta, chiudendolo con un connettore. Il connettore è utilizzato per sigillare la pipetta che sarà poi collegato alla linea aerea tubo di una pompa ad aria quando è il momento di consegnare l'odore durante l'esperimento.
2. Odore di consegna del sistema
- Utilizzando un piccolo trapano, tagliare un 10 ml di plastica pipetta sierologica (ad esempio in 4 ml di marchio) e creare due buchi (per esempio al ml -1,5 e -0,5 punti mL) che verrà utilizzato per contenere le pipette contenenti gli odori. Inserire una punta di 200 microlitri pipetta in attacco spinato e introdurre l'accoppiatore in punta smussata della pipetta 10 ml. La pipetta verrà utilizzato come parte del sistema di consegna per odoranti.
- Fissare la pipetta su un supporto magnetico con una pinza pipetta e posizionarlo vicino al microscopio.
3. Elettrodi affilatura
- Per affilare gli elettrodi, preparare una soluzione 0,5 M di idrossido di potassio (KOH) e filtro per rimuovere le polveri sottili (ad esempio utilizzando un filtro di 45 micron). Prendete una siringa da 20 ml e fare un piccolo foro (circa 2 mm di diametro) usando un ago sul muro vicino alla punta (~ 1 cm dalla punta), in cui viene inserito il filo elettrico (Figura 1A).
- Riempire la siringa con 0,5 M KOH, e bloccarlo su un supporto al microscopio in modo che la punta si trova nel campo di vista (Figura 1B, C). Inserire il filo elettrico nel piccolo foro sul muro siringa (Figura 1B), assicurandosi che il filo non è direttamente di fronte all'ingresso della siringa. Collegare questo filo al catodo di un alimentatore DC (ad esempio, Wild Heerbrugg MTR32, vedi metodi) o un polo di un alimentatore AC (es. Wild Heerbrugg LEP-990018). Fissare l'albero portaelettrodo sul micromanipolatore manuale sul lato destro del microscopio, e collegare un cavo elettrico alla base del pozzo elettrodo titolare con un coccodrillo. Collegare il cavo verso l'anodo della tensione di alimentazione DC o l'altro polo della tensione di alimentazione AC (Figura 1A).
- Inserire il filo di tungsteno (~ 5 cm di lunghezza) nel portaelettrodo, e collegarlo con l'albero elettrodo titolare del manipolatore. Impostare l'alimentazione a 6 V, e inserire la punta del filo nella siringa ripetutamente per affinare esso, facendo attenzione a monitorare la punta al microscopio durante il processo (Figura 1C). Per ottenere un elettrodo ideale per la registrazione, posto al 90% della sua lunghezza nella soluzione per un massimo di 1 minuto, ed estrarlo lentamente. Quindi inserire solo circa il 50% degli elettrodi ad ulteriori sottili per 30 s, e ripeterlo per ottenere la punta del filo affilato (~ 10 volte).
La punta dell'elettrodo deve essere abbastanza sottile per entrare nella sensillum, ma non così bene come piegare quando si tocca durante le registrazioni (i punti 6 e 7). Anche se a guardare la punta dell'elettrodo sotto il microscopio da dissezione mentre viene affilata è una buona indicazione del suo spessore, solo guardando al microscopio ad alto ingrandimento registrazione darà una chiara idea se un elettrodo dato è adatto per la registrazione.
4. Insetti di preparazione: Drosophila antenna
- Costruire un aspiratore volare. Tagliare un pezzo di tubo linea d'aria abbastanza a lungo per appendere comodamente al collo (circa 90 - 120 cm). Tagliare la punta di una punta di 200 microlitri pipetta e inserirlo in una delle estremità del tubo. Dall'altro fine, la posizione di un ~ 1.5 cm x 1.5 cm di pezzo rete in modo che crea una barriera fisica ma non impedisce il flusso dell'aria dal tubo. Tagliare la punta di una punta di pipetta da 1 ml e la posizione alla fine più ampio sulla parte superiore del tubo di apertura, bloccando la rete in mezzo. Questa parte sarà utilizzata per raccogliere e manipolare le mosche aceto adulto (Figura 2).
- Prendere un vetrino da microscopio e luogo un pezzo di cera dentale o meno a metà del lato lungo. Su di esso positiona copertura in vetro leggermente inclinato verso l'alto (~ 30), facendo in modo che la cera non è direttamente sotto la parte più alta, che impedirebbe la visualizzazione del moscerino della frutta sotto il microscopio. Tirare un elettrodo di vetro con l'estrattore verticale. La sua punta deve essere sottile e sufficientemente flessibile per adattarsi tra il secondo e il terzo segmento antennale, e mantenere la stabilità antenna per le registrazioni. Posizionare l'elettrodo di vetro su un altro pezzo di cera e posizionarlo sul lato del vetro di copertura, è tale che quando la punta si abbassa a raggiungere l'angolo del vetro di copertura (Figura 3A).
- Lavoro da una bottiglia o flacone di mosche adulte del genotipo desiderato, prendere un volo per adulti aceto con l'aspiratore volare. Anche se le femmine sono solitamente utilizzati a causa delle loro dimensioni più grandi, i maschi possono anche essere utilizzati. Inserire una punta di 200 microlitri pipetta sulla sommità della punta da 1 ml per evitare la fuoriuscita di volare. Soffiare nel tubo, in modo che la mosca è spinto verso la fine della punta della pipetta 200 microlitri. Tagliare la parte più larga della punta della pipetta con la lama di rasoio di pochi millimetri di distanza dal volo stesso, quindi inserire la cera per evitare che al volo da tirarsi indietro. Sotto un microscopio, tagliare di nuovo vicino alla testa della mosca aceto, facendo attenzione a non danneggiare l'animale. Con un puntale piccolo, spingere la cera per forzare la testa volare in modo che circa la metà degli occhi estrudere dalla punta (Figura 3B). Assicurarsi che le gambe non escono pure, o potrebbero muoversi e interferire con le registrazioni.
- Montare il volo su un pezzo di cera, con la testa rivolta verso l'alto, e posizionarlo sul vetrino di fronte al vetro di copertura. Spingere la testa leggermente contro l'angolo del vetro, in modo che le antenne estendono e riposo sul vetro. Abbassare la punta del capillare di vetro tra il secondo e il terzo segmento antennale (Figura 3B).
- Diverse parti del antenna darà accesso a diversi tipi di sensilli. A seconda dei particolari esigenze di sperimentazione, l'antenna dovrà essere orientata in modo diverso per consentire l'accesso a diversi tipi di sensilli. Per registrare da grandi sensilli basiconic come nel nostro esempio, l'arista viene spinto verso il basso sul vetro (Figura 3B).
5. Insetti di preparazione: Anopheles palpi mascellari
- L'utilizzo di un aspiratore elettrico (2E Figura), raccogliere 40-60 3-5 giorni zanzare vecchi (maschi e femmine misto) nella gabbia di plastica (Figura 2F). Le zanzare avrebbe dovuto essere allevati in condizioni normali, cioè in un insetto o insectary incubatore a 25-28 ° C con 70-80% di umidità. Posizionare la gabbia di plastica con gli animali su ghiaccio per circa 15 minuti fino a quando non sono anestetizzati dal freddo. Una volta che gli animali hanno smesso di muoversi, il trasferimento di solo il 4-6 animali allo stadio sotto il microscopio in qualsiasi momento, mantenendo il resto degli animali sul ghiaccio durante le procedure. Anche se le femmine sono solitamente utilizzati per la loro sensibilità alla CO 2, maschi possono anche essere impiegati. Selezionare le zanzare femmina o maschio, a giudicare dalla struttura della loro antenna (piuma-come nelle femmine, filamento simile nei maschi), e rimuovere le ali e le gambe con una pinza sottile per immobilizzare loro. Tenerli in un bicchiere di plastica con una piccola carta bagnata in fondo, per impedire loro di seccare.
- Mettere due pezzi di nastro biadesivo (~ 1 cm di lunghezza) paralleli tra loro (~ 1 cm di distanza), al centro e ai lati del vetro diapositive (Figura 3C). Utilizzando una pinza sottile, porre una zanzara sul nastro centrale sotto il microscopio da dissezione, e ruotare lateralmente e bastone il suo corpo e un occhio sul nastro. Regolare la posizione del palpi mascellari in modo che entrambe palpi estendere parallelo sul nastro (Fig. 3D). Fissare la palpi mascellari mettendo corde sottili (ad esempio capelli umani) sia alla base e sulla punta della palpi (Figura 3D). Il nastro laterale è usata come repository per le corde sottili, mentre il nastro centrale deve essere sostituito dopo ogni registrazione (Figura 3C).
6. Registrazione di Drosophila melanogaster
- Mettere il vetrino sotto il microscopio (Figura 4A) a basso ingrandimento e posizionare l'antenna o meno al centro del campo visivo (FOV) (Figura 4B). Abbassare delicatamente gli elettrodi in modo che l'elettrodo di riferimento si trova vicino l'occhio della mosca e l'elettrodo di registrazione è vicino all'antenna (Figura 4C). Aumentare l'ingrandimento e riposizionare l'antenna al centro del FOV (fig. 4D).
- Luogo la consegna vicino odore dispositivo alla testa della mosca, indicando l'antenna.
- A basso ingrandimento (Figura 4C), inserire l'elettrodo di riferimento negli occhi della mosca. Abbassare l'elettrodo di registrazione in cima dell'antenna, senza toccare la superficie.
- Il passaggio a forte ingrandimento, controllo l'elettrodo di registrazione con il micromanipolatore e inserirla in un sensillum selezionato (Figura 4D). Qualsiasi punto della lunghezza sensillum è buono per la registrazione. Una volta all'interno della sensillum, l'elettrodo può essere spinto più in (a volte fino in fondo)per ottenere un segnale migliore per rumore. Una volta che l'elettrodo è in sensillum, l'attività spontanea delle cellule possono essere rilevati.
7. Registrazione Anopheles gambiae
- Posizionare il vetrino sotto il microscopio a basso ingrandimento (10x) e posizionare la palpi mascellari all'incirca nel mezzo del campo visivo e la testa in alto (Figura 4E). Ruotare lo stadio fino a quando uno dei palpi è ad angolo retto con l'elettrodo di registrazione.
- Regolare l'altezza degli elettrodi in modo che l'elettrodo di riferimento è posizionato appena sopra l'occhio della zanzara e l'elettrodo di registrazione è vicino al palpi mascellari.
- Posizionare il dispositivo di erogazione odore in modo che sia il più vicino possibile al palpi.
- Inserire l'elettrodo di riferimento negli occhi a basso ingrandimento (10x), e di passare al più alto ingrandimento (100x), inserire l'elettrodo di registrazione nel sensillum piolo sul palp (4F Figura). Una volta che l'elettrodo è in sensillum, l'attività spontanea delle cellule possono essere rilevati.
8. Rappresentante risultati
A seconda del sensillum e la qualità della registrazione, si possono distinguere un diverso numero di neuroni olfattivi all'interno di una singola traccia. Nel sensilli grande basiconic di Drosophila melanogaster, per esempio, tra 2 e 4 cellule che si differenziano per ampiezza picco dovrebbe comparire durante la registrazione 9, 10.
Nel nostro esperimento video, la Drosophila AB2 sensillum mostra due cellule, una A cella (Figura 5, picchi blu) e una cellula B (Figura 5, picchi verdi). Nessuno dei due cellulari è attivato durante l'applicazione di olio di paraffina (Figura 5A), mentre solo il Una cellula risponde alla diluizione 10 -6 di acetato di metile (Figura 5B).
Nel palp mascellare di Anopheles gambiae, il scanalate piolo sensillum contiene tre celle, ma solo due sono facilmente discriminati (Figura 5C, picchi blu e verde, rispettivamente). Nell'esperimento video che mostra come la cellula B risponde a un -7 10 diluizione di 1-octen-3-olo (Figura 5D).
Figura 1. Elettrodo temperamatite
(A) Veduta generale dell'apparato elettrodo temperamatite. (B) La siringa contenente 0,5 M KOH (a sinistra) utilizzati per affinare l'elettrodo (a destra). (C) primo piano la punta dell'elettrodo successivo all'apertura della siringa.
Figura 2. Come preparare un aspiratore mosca e aspiratore zanzara
(A) A partire materiale:... Tubi in linea d'aria in plastica, due puntali taglio, e mesh (B) L'aspiratore volare una volta che è completato (C) Particolare del fine che viene utilizzato per catturare le mosche aceto (D) Particolare l'altra estremità del aspiratore volare. (E) L'aspiratore elettrico per la raccolta delle zanzare è costituito da un corpo principale e una gabbia in plastica staccabile. (F) La gabbia di plastica staccabile per le zanzare.
Figura 3. Preparazione di un moscerino della frutta (Drosophila melanogaster) e una zanzara della malaria (Anopheles gambiae) per la registrazione
(A) Immagine di un aceto volano montato sulla diapositiva prima di posizionare sotto il microscopio. (B), primo piano della testa del moscerino della frutta con l'antenna mantenuto in posizione dalla capillare di vetro. (C) Immagine di una zanzara montato su la diapositiva. (D) primo piano della testa zanzara con proboscide e palpi attaccare sul nastro.
Figura 4. Registrazione da un moscerino della frutta (Drosophila melanogaster) e una zanzara della malaria (Anopheles gambiae)
(A) Vista l'impostazione elettrofisiologia. (B), primo piano della preparazione volano montato sul microscopio. Si noti la rispettiva posizione degli elettrodi di registrazione (a sinistra), il sistema di erogazione degli odori (al centro pipetta), e l'elettrodo di registrazione (a destra). (C) Immagine della mosca nell'ambito dell'obiettivo 10x. (D) Immagine dell'antenna volare sotto l'obiettivo 100x;. sensilli grande basiconic (frecce), intervallati tra i non-sensoriale capelli (punte di freccia) (E) 10x vista di una zanzara montato per la registrazione (F) vista Alto ingrandimento: il palp zanzara e un sensillum PEG (freccia). .
Figura 5. Esempi di registrazioni da Drosophila melanogaster eAnopheles gambiae
(A) La sensillum ab2 di Drosophila melanogaster ospita due neuroni sensoriali;.. A cella (picchi blu) e delle cellule B (punte verdi) (B) Le cellule A e B durante l'applicazione del 10 -6 acetato di metile (C) L' peg sensillum di Anopheles gambiae ospita due neuroni sensoriali, il Una cellula (picchi blu) e delle cellule B (punte verdi) (D) Applicazione del 10 -7 1-octen-3-ol per i sensillum piolo..
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Discussion
Stimoli olfattivi vengono utilizzati dagli organismi di identificare fonti di cibo, potenziali compagni, e predatori. Neuroni sensoriali olfattivi (OSNs) sono al centro primo relè tra stimoli esterni e centri superiori del cervello dove le informazioni vengono successivamente trattati. In Drosophila melanogaster e Anopheles gambiae, OSNs sono facilmente accessibili e la loro attività elettrica possono essere monitorati, mentre stimolato da sbuffi odore.
Il singolo di registrazione sensillum (SSR) tecnica spiegato in questo video è stato ampiamente utilizzato per registrare da OSNs e studiare la loro risposta elettrica ad un gran numero di odoranti 6, 7. Il deorphanization di recettori olfattivi (OR) 6, 11 e la mappatura delle RUP alle posizioni specifiche sull'antenna Drosophila 9, 12, 13 ha fatto la tecnica SSR un potente strumento per analizzare le proprietà elettrofisiologiche delle RUP specifici in vivo, come un primo passo per capire come il mondo esterno olfattivo si traduce in segnali elettrici attraverso i suoi OSNs ed eventualmente percepito dall'animale.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin oil | Odors | Fluka | 76235 | |
| High purity odors (>98%) | Odors | Sigma-Aldrich | Methyl acetate #296996 1-octen-3-ol #74950 |
|
| Filter paper strips | Odors | Fisher Scientific | 05-714-1 | Chromatography paper |
| Connectors | Odors | Cole-Parmer | EW-06365-40 | 1/16x1/8" |
| Glass vials | Odors | Agilent Technologies | 5182-0556 | |
| Air line plastic tubing | Odor Delivery | Python Products | 500PAL | |
| 1 serological pipette | Odor Delivery | Corning | 4101 | 10 mL |
| Plastic tubing | Odor Delivery | Cole-Parmer | EW-06418-0 | 0.050"x0.090"OD |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipettes | Odor Delivery | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5-3/4 inches |
| Programmable stimulus controller | Odor Delivery | Syntech | CS-55 | |
| Anti-vibration table | Electrophysiology Equipment | TMC | 63533 | 36”Wx30”Dx29”H |
| Faraday cage | Electrophysiology Equipment | TMC | MI8133303 | |
| Inverted microscope | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | E600FN ECLIPSE | Recording microscope |
| 10x and 100x objectives | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | 10x Plan Fluor 100x L Plan | |
| Dissecting microscope | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | EZ645 | electrode sharpening/insect prep microscope |
| Magnetic stands | Electrophysiology Equipment | Newport Corp. | MODEL 150 | |
| IDAC | Electrophysiology Equipment | Syntech | IDAC-4 | |
| Acquisition software | Electrophysiology Equipment | Syntech | Autospike | |
| 1 macromanipulator | Electrophysiology Equipment | Narishige International | MN-151 | Joystick manipulator Used for positioning reference electrode |
| 1 micromanipulator | Electrophysiology Equipment | EXFO | PCS-6000 | Used for positioning recording electrode |
| Crocodile clip | Electrophysiology Equipment | Pomona | AL-B-12-0 | |
| Electric cable | Electrophysiology Equipment | Pomona | B-36-0 | Test Cable Assembly |
| 2 electrode holders | Electrophysiology Equipment | Syntech | N/A | Electrode holders (set of 2) for tungsten wire electrode |
| AC probe | Electrophysiology Equipment | Syntech | N/A | Universal single ended probe (10xAC) |
| Tungsten electrodes | Electrophysiology Equipment | Microprobes | M210 | straight tungsten rods, 0.005x3 |
| Potassium hydroxide | Electrophysiology Equipment | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Syringe | Electrophysiology Equipment | BD Biosciences | 301625 | 20 mL |
| Power supply | Electrophysiology Equipment | Wild Heerbrugg | e.g MTR32 | |
| Vertical puller | Insect prep | Narishige International | PB-7 | |
| Razor blade | Insect prep | VWR international | 55411-050 | |
| Dental wax | Insect prep | Patterson | 091-1503 | |
| Microscope slide | Insect prep | Fisher Scientific | 12-550A | |
| Cover glass | Insect prep | Fisher Scientific | 12-541A | 18X18 #1.5 |
| Polypropylene mesh | Insect prep | Small Parts, Inc. | CMP-0500-B | |
| Glass electrode | Insect prep | Frederick Haer and Co. | 27-32-0-075 | Capillary tubing borosilicate 1.5mm OD x 1.12mm ID x 75 mm |
| Double-sided tape (3M) | Insect prep | 3M | MMM6652P3436 | Double-sided tape (3M) |
| Forceps | Insect prep | Fine Science Tools | 021x0053 | Dumont #5 Mirror Finish Forceps |
| Small plastic cup | Insect prep | VWR international | 89009-662 | 7 x 5.7 (23/4 x 21/4) |
| Electric aspirator | Insect prep | Gempler’s | RHM200 |
References
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