Summary
臭気物質の嗅覚ニューロンの電気生理学的応答は、単一感覚子記録を使って昆虫で測定することができます。このビデオの記事では、ショウジョウバエの触角の単一感覚子記録を実行する方法を紹介します（
Abstract
嗅覚は、食品、仲間、捕食者、および産卵部位3を見つけるために昆虫のために不可欠です。昆虫嗅覚神経細胞は（OSNs）嗅覚器官の表面を覆う感覚器と呼ばれる感覚毛、で囲まれています。各感覚子の表面は、経由する付臭剤が通過すると、特定の感覚子に収容OSNsの感覚樹状突起をbathes感覚子リンパと呼ばれる液体に溶解、小さな孔で覆われている。 OSNの樹状突起は、その昆虫の機能の臭気依存性イオンチャネル4、5として、嗅覚受容体（OR）タンパク質を発現。論理和のいずれかが増大したり、OSNの基礎発火率を減少させると匂い物質の相互作用。活動電位の形でこのニューロン活動は、品質、強度、そして匂い6,7の時間特性の最初の表現を体現しています。
これらの感覚毛への容易なアクセスを考えると、それは、参照電極は、昆虫の目や身体のリンパ節に置かれている間、感覚子リンパに記録電極を導入することにより、単一OSNsから細胞外記録を行うことが可能である。一から四OSNs間ショウジョウバエ 、感覚器家の中で、しかしそれぞれのOSNは、通常、特徴的なスパイクの振幅が表示されます。スパイクソーティングの技術は個々のOSNsにスパイク応答を割り当てることが可能となります。この単一感覚子記録（SSR）技術は、感覚子リンパとOSNs 1、2、8の受容体活性によって生成される電気的なスパイクのような参照電極間の電位差を監視します。匂い物質に対する応答のスパイク数の変化は、昆虫でコーディング匂いの細胞学的根拠を示している。ここで、我々は現在、 キイロショウジョウバエやハマダラカにSSRを実行するために私たちのラボで使用される調製法を説明し、感覚子特異的に着臭剤により誘導される代表的なトレースを示しています。
Protocol
1。臭気の希釈
- ほとんどの臭気物質は、パラフィン油に可溶である。しかし、DMSOまたはエタノールはまた、特定の臭気のための代替溶媒として使用することができます。ガラスバイアルに純粋なニオイから：;：適切な希釈液を（V Vボリュームなど1時10ボリューム）を用意します。最も臭気の希釈液は、室温で安定ですが、非常に揮発性化合物のためにそれが週単位で作業希釈をするのが良いです。各感覚子には、異なる濃度の範囲内で別の匂いに応答します。 ショウジョウバエの場合は、特定の感覚子で使用する適切な濃度の有用なルックアップテーブルは、6、7に見つけることができます。
ショウジョウバエやハマダラカのためにビデオの実験では、溶媒対照と酢酸メチルとパラフィンオイルを使用してください（10 -6 V：：パラフィン油のV）と（パラフィンオイルでV 10 -7 V）1 -オクテン-3 -オールそれぞれの録音、。 - はさみを使用して、彼らはパスツールピペット内に収まること× 5 cmのストリップので、3ミリメートルにクロマトグラフィーの紙をカット。
- ピペット30は、濾紙のストリップ上に所望の臭気のμLとガラスピペットに挿入します。 〜エアラインチューブの3センチカットしてコネクタでそれを閉じ、ピペットの開放端に挿入します。コネクタは、実験中に臭気を提供する時刻になるとして空気ポンプのエアラインのチューブに添付されるピペットを密封するために使用されます。
2。臭気の配信システム
- 小さなドリルを使用して、10 mLのプラスチック製の血清学的ピペットを（4 mLのマークでなど）切断し、悪臭を含むピペットを保持するために使用される2つの穴を（例えば-1.5 mLおよび-0.5 mLのマークで）作成します。とげのあるカプラーの200μLピペットの先端を挿入し、10 mLのピペットの平滑末端に連結器を導入する。ピペットは、臭気物質の配信システムの一部として使用されます。
- ピペットのクランプを磁気スタンドにピペットを取り付け、顕微鏡の近くに配置します。
3。シャープニング電極
- 電極をシャープに、水酸化カリウムの0.5M溶液（KOH）を準備し、微粒子を（例えば、45μmのフィルターを使用して）削除するには、それをフィルタリングする。 20 mLの注射器を取ると密接な先端（先端から約1 cm）に壁に針を使って小さな穴（〜2mmの直径を）して、電線が挿入されている（図1A）。
- 0.5 M KOHで注射器をいっぱいにし、先端がビューのフィールド（図1B、C）に配置されるように、顕微鏡下で台にクランプ。ワイヤーが注射器の入り口の正面にはないことを確認して、注射器壁（図1B）の小さな穴に電線を挿入します。 DC電源装置（例えば、ワイルドHeerbrugg MTR32、メソッドを参照）またはAC電源（例えば、ワイルドHeerbrugg - LEP 990018）の極のカソードにこの線を接続します。顕微鏡の右側に手動マニピュレーターに電極ホルダーのシャフトを装着し、ワニクリップで電極ホルダーのシャフトの根元に電気ケーブルを取り付けます。 DC電源装置またはAC電源装置（図1A）の他の極のアノードにケーブルを接続します。
- 電極ホルダーにタングステン線を（〜5cmの長さ）を挿入し、マニピュレータの電極ホルダーのシャフトに取り付けます。プロセス（図1C）の間に顕微鏡下で先端を監視するように注意して、6 Vの電源を設定し、それを磨くために繰り返し注射器にワイヤーの先端を挿入します。記録のための理想的な電極を得るために、最大1分までのソリューションで、その長さの90％を置き、それをゆっくりと引き出します。その後30秒間、さらに薄くするために〜のみ電極の50％を挿入し、（〜10回）シャープワイヤの先端を得るためにそれを繰り返す。
電極の先端は、それが録音（ステップ6および7）の間にそれを触れたときに曲げるように罰金感覚子に入力するのに十分な細かさになるはずです。それがシャープしている間に解剖顕微鏡下で電極の先端を見て与えられた電極は、記録に適しているかどうか明確な考えを与えるだけの高倍率で記録顕微鏡下でそれを見て、その厚さを示す指標になりますが。
4。昆虫準備： ショウジョウバエアンテナ
- フライアスピレーターを構築する。 （ - 120センチメートル約90）に十分な長さ、首周りに快適にハングアップするエアラインのチューブをカット。 200μLピペットチップの先端をカットし、チューブの一端に挿入します。それは物理的な障壁を作成しますが、チューブから流出から空気を妨げるものではない、もう一方の端、位置メッシュの約1.5センチ× 1.5cmの部分でのように。の間にメッシュをブロックし、チューブ開口部の上部にある1 mLのピペットチップとの位置より広い終わりの先端をカット。この部分はピックアップして、成人の酢のハエ（図2）を操作するために使用されます。
- 顕微鏡のスライドを取ると大体長辺の中央にある歯科ワックスのピースを置きます。それpositioの上にガラスをカバーするNaのは、わずかにワックスを直接顕微鏡下でショウジョウバエの視覚化を妨げる最上部、下ではないことを確認して、上向きに（〜30）傾ける。縦引き手でガラス電極を引き出します。その先端は薄く、2番目と3番目の触角のセグメントの間に収まるように十分な柔軟性、そして録音のためにアンテナの安定を保つ必要があります。ワックスの別の部分にガラス電極を置き、十分先端が低下した場合は、カバーガラス（図3A）のコーナーに到達することを、カバーガラスの側面上に置きます。
- 目的の遺伝子型の大人のハエのボトルやバイアルから作業し、その場で吸引器を使って大人酢のフライをピックアップ。女性が通常のため、その大きなサイズから使用されていますが、男性も使用することができます。エスケープからハエを避けるために、1 mLのチップの上に200μLのピペットチップを置きます。フライを200μLピペットの先端の終わりに向かって押されているように、チューブに吹く。数ミリ離れてハエ自体からかみそりの刃を持つピペットチップの広い方の端をトリミングして、バックアウトからハエを防ぐために、いくつかのワックスを挿入します。顕微鏡下で、動物を傷つけないように注意を払って、ショウジョウバエの頭部の近くで再びカット。小さなピペットの先端で、目の約半分は先端（図3B）から押し出すようにフライのヘッドを強制的にワックスを押してください。その足も同様に出ていない、または彼らがレコーディングして移動すると干渉する可能性があることを確認してください。
- ワックスのピースのフライ、上を向いて頭をマウントし、カバーガラスの前のスライドの上に置きます。アンテナを拡張し、ガラスの上に物を置かないように、ガラスの角に対してわずかに頭を押してください。 2番目と3番目の触角のセグメント（図3B）との間にガラスキャピラリーの先端を下げます。
- アンテナの異なる部分は異なる感覚器の種類にアクセスできるようになります。特定の実験のニーズに応じて、アンテナは異なる感覚器の種類へのアクセスを許可するように異なる指向になる必要があります。私たちの例のように大規模なbasiconic感覚器から録音するには、アリスタは、ガラス（図3B）にプッシュされています。
5。昆虫準備： ハマダラカ上顎palps
- 電動吸引器（図2E）を使用して、小さなプラスチック製のケージ（図2F）で40から60まで3-5日の古い蚊を（混合オスとメス）を収集。蚊は25から28で昆虫インキュベーターや昆虫館で、すなわち、通常の条件下で飼育されている必要があります° Cで70〜80％の湿度。彼らは寒さで麻酔されるまで約15分間氷上で動物と一緒に小さなプラスチック製のケージを置きます。動物は移動を停止した後、手続き中に氷の上の動物の残りの部分を維持、一度に顕微鏡下のステージにのみ4月6日の動物を譲渡する。女性が通常のため、CO 2への感受性が使用されていますが、男性も使用することができます。彼らのアンテナの構造（フィラメントのような男性の女性、の羽のような）から判断すると、メスまたはオスの蚊を選択し、それらを固定するために微細な鉗子で羽や脚を取り外します。乾燥剤からそれらを防ぐために、下部の湿紙と小さなプラスチックのカップに保管してください。
- 両面テープの2つの部分（長さは約1センチ）が互いに平行に（〜1センチは離して）、中央に、スライドガラス（図3C）の側に置く。細かい鉗子を使用して、解剖顕微鏡下で、中央のテープに蚊を配置し、横にそれを回すと、テープ上にその身体と片目を貼り付けます。両方palpsがテープ（図3D）に平行に延びるように上顎palpsの位置を調整します。ベースでとpalps（図3D）の先端の両方薄い文字列（例えば、ヒトの毛を）置くことによって上顎palpsを修正。中央のテープはすべての記録（図3C）の後に交換する必要がある一方側のテープは、薄い文字列のためのリポジトリとして使用されます。
6。録音キイロショウジョウバエ
- 低倍率と位置をほぼ視野（FOV）の中央（図4B）のアンテナで顕微鏡（図4A）の下にスライドを置きます。ゆっくりと参照電極がフライと記録電極がアンテナの近くにある（図4C）の眼の近くに位置するように電極を下げます。倍率と再位置FOV（図4D）の中央にアンテナを増やします。
- アンテナを指して、ハエの頭部への臭気の送達デバイスの近くに配置。
- 低倍率（図4C）で、フライのアイに参照電極を挿入する。その表面に触れることなく、アンテナの上に記録電極を下ろします。
- 高倍率への切り替え、マイクロマニピュレータと記録電極を制御し、選択した感覚子（図4D）に挿入します。感覚子の長さに沿った任意の点は記録に適しています。一度感覚子の内部に、電極が遠い（場合によっては全ての手段を介して）にプッシュすることができます。対雑音比よりよい信号を得ることができる。電極は、感覚子になると、細胞の自発的活動を検出することができます。
7。録音ハマダラカ
- 低倍率（10倍）とほぼFOVと上部の頭の真ん中に位置上顎のpalpsので顕微鏡下でスライドガラスを配置し（図4E）。 palpsのいずれかが記録電極と直角になるまでステージを回転させます。
- 参照電極は、ちょうど蚊と記録電極は、上顎palpsの近くにあるの眼の上方に位置されるように、電極の高さを調整します。
- それはできるだけ近いpalpsになるように臭気の配信デバイスを入れます。
- 低倍率（10倍）で、目の中に参照電極を挿入し、高倍率（100倍）に切り替え、PALPでペグの感覚子（図4F）に記録電極を挿入する。電極は、感覚子になると、細胞の自発的活動を検出することができます。
8。代表的な結果
感覚子と録音の質に応じて、一つは、単一のトレース内の嗅覚神経細胞の異なる番号を区別することができます。 キイロショウジョウバエの大basiconic感覚器では、例えば、スパイクの振幅が異なる2〜4セルの録音9、10の間に表示されます。
私たちのビデオの実験では、 ショウジョウバエ AB2感覚子は、2つのセル、セル（図5、青いスパイク）とB細胞（図5、緑のスパイク）を示しています。唯一の細胞は、メチル、酢酸の10 -6希釈（図5B）に応答しながらどちらの細胞は、パラフィン油（図5A）の適用時にアクティブ化されます。
ハマダラカの小顎鬚には、溝付きペグ感覚子には3つのセルが含まれていますが、2つだけは簡単に（図5C、青と緑のスパイク、それぞれ）差別されています。ビデオの実験では、B細胞は（図5D）1 -オクテン-3 -オールの10 -7希釈に応答する方法を示します。
図1。電極シャープナー
電極削り装置の（A）一般的なビュー。（B）注射器の開口部に横に電極先端から（C）クローズアップ電極（右）シャープに使用される0.5 M KOHを（左）。入った注射器。
図2。フライアスピレーターと蚊の吸引器を準備する方法
（A）材料の開始：。。。のエアラインのプラスチックチューブ、2つの切断ピペットチップ、およびメッシュを（B）フライ吸引器、それが完了すると（C）酢のハエをキャッチするために使用されるエンドの詳細は、（D）詳細フライアスピレーターのもう一方の端。（E）蚊のコレクションのための電動吸引器は、本体と取り外し可能なプラスチック製のケージで構成されています。蚊用（F）取り外し可能なプラスチック製のケージ。
図3。ショウジョウバエ（ キイロショウジョウバエ ）と記録のためのマラリア蚊（ ハマダラカ ） を準備
（A）酢の画像は、顕微鏡下でそれを配置する前に、スライド上にマウントされて飛ぶ。（B）ガラスキャピラリーによって所定の位置に保持されているアンテナとショウジョウバエの頭部のクローズアップ。（C）蚊の画像が上に搭載スライド（D）クローズアップテープで貼り口吻とpalpsと蚊の頭の。
図4。ショウジョウバエ（ キイロショウジョウバエ ）とマラリア蚊（ ハマダラカ ）からの録音
（A）電気生理学のセットアップの表示。（B）クローズアップ、フライの準備が顕微鏡に搭載された。フライアンテナの記録電極（左）、臭気デリバリーシステム（中央ピペット）、および記録電極（右）のそれぞれの位置を注意してください。（C）10 ×目標の下にフライの画像。（D）画像の下に100xの目的;。レコーディングのためにマウントされている蚊の非感覚毛（矢頭）の間に散らばっ大きなbasiconic感覚器（矢印）、（E）10 ×ビュー蚊のPALPとペグ感覚子（矢印）の（F）高倍率ビュー。 。
図5。 キイロショウジョウバエからの録音の例とハマダラカ
（A） キイロショウジョウバエのAB2の感覚子には2つの感覚ニューロン収容する;。。細胞（青スパイク）とB細胞（緑のスパイクを）（B）10 -6酢酸メチルのアプリケーションの間とB細胞（C）細胞（青スパイク）とB細胞（緑スパイク）10 -7ペグ感覚子へ1 -オクテン-3 -オールの（D）アプリケーション、。 ハマダラカのペグ感覚子は2つの感覚ニューロンを収容する。
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Discussion
嗅覚手がかりは、食料源、潜在的な仲間、そして捕食者を識別するために、生物によって使用されます。嗅覚ニューロン（OSNsは）外部からの刺激や情報が処理される脳の高次中枢との間の最初のリレーの中心です。 キイロショウジョウバエやハマダラカでは、OSNsは簡単にアクセス可能であり、臭気のパフで刺激しながら、その電気的活動をモニターすることができます。
単一感覚子記録（SSR）技術は、広くOSNsから録音すると匂い6,7の多数にそれらの電気的反応を研究するために使用されているこのビデオで説明。嗅覚受容体（ORS）6、11、 ショウジョウバエアンテナ9、12、13上の特定の場所にORのマッピングのdeorphanizationは、最初のように、SSRの技術を生体内で特定の論理和の電気生理学的特性を分析するための強力なツールを作られている外部嗅覚世界がそのOSNsを通して電気信号に変換し、最終的には動物によって知覚される方法を理解するステップ。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin oil | Odors | Fluka | 76235 | |
| High purity odors (>98%) | Odors | Sigma-Aldrich | Methyl acetate #296996 1-octen-3-ol #74950 |
|
| Filter paper strips | Odors | Fisher Scientific | 05-714-1 | Chromatography paper |
| Connectors | Odors | Cole-Parmer | EW-06365-40 | 1/16x1/8" |
| Glass vials | Odors | Agilent Technologies | 5182-0556 | |
| Air line plastic tubing | Odor Delivery | Python Products | 500PAL | |
| 1 serological pipette | Odor Delivery | Corning | 4101 | 10 mL |
| Plastic tubing | Odor Delivery | Cole-Parmer | EW-06418-0 | 0.050"x0.090"OD |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipettes | Odor Delivery | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5-3/4 inches |
| Programmable stimulus controller | Odor Delivery | Syntech | CS-55 | |
| Anti-vibration table | Electrophysiology Equipment | TMC | 63533 | 36”Wx30”Dx29”H |
| Faraday cage | Electrophysiology Equipment | TMC | MI8133303 | |
| Inverted microscope | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | E600FN ECLIPSE | Recording microscope |
| 10x and 100x objectives | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | 10x Plan Fluor 100x L Plan | |
| Dissecting microscope | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | EZ645 | electrode sharpening/insect prep microscope |
| Magnetic stands | Electrophysiology Equipment | Newport Corp. | MODEL 150 | |
| IDAC | Electrophysiology Equipment | Syntech | IDAC-4 | |
| Acquisition software | Electrophysiology Equipment | Syntech | Autospike | |
| 1 macromanipulator | Electrophysiology Equipment | Narishige International | MN-151 | Joystick manipulator Used for positioning reference electrode |
| 1 micromanipulator | Electrophysiology Equipment | EXFO | PCS-6000 | Used for positioning recording electrode |
| Crocodile clip | Electrophysiology Equipment | Pomona | AL-B-12-0 | |
| Electric cable | Electrophysiology Equipment | Pomona | B-36-0 | Test Cable Assembly |
| 2 electrode holders | Electrophysiology Equipment | Syntech | N/A | Electrode holders (set of 2) for tungsten wire electrode |
| AC probe | Electrophysiology Equipment | Syntech | N/A | Universal single ended probe (10xAC) |
| Tungsten electrodes | Electrophysiology Equipment | Microprobes | M210 | straight tungsten rods, 0.005x3 |
| Potassium hydroxide | Electrophysiology Equipment | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Syringe | Electrophysiology Equipment | BD Biosciences | 301625 | 20 mL |
| Power supply | Electrophysiology Equipment | Wild Heerbrugg | e.g MTR32 | |
| Vertical puller | Insect prep | Narishige International | PB-7 | |
| Razor blade | Insect prep | VWR international | 55411-050 | |
| Dental wax | Insect prep | Patterson | 091-1503 | |
| Microscope slide | Insect prep | Fisher Scientific | 12-550A | |
| Cover glass | Insect prep | Fisher Scientific | 12-541A | 18X18 #1.5 |
| Polypropylene mesh | Insect prep | Small Parts, Inc. | CMP-0500-B | |
| Glass electrode | Insect prep | Frederick Haer and Co. | 27-32-0-075 | Capillary tubing borosilicate 1.5mm OD x 1.12mm ID x 75 mm |
| Double-sided tape (3M) | Insect prep | 3M | MMM6652P3436 | Double-sided tape (3M) |
| Forceps | Insect prep | Fine Science Tools | 021x0053 | Dumont #5 Mirror Finish Forceps |
| Small plastic cup | Insect prep | VWR international | 89009-662 | 7 x 5.7 (23/4 x 21/4) |
| Electric aspirator | Insect prep | Gempler’s | RHM200 |
References
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