在斑马鱼胚胎的单个神经元和神经嵴细胞的细胞运动和肌动蛋白细胞骨架的实时成像

Summary

本协议描述了生活的斑马鱼胚胎的单个神经元或神经嵴细胞成像。使用此方法来研究细胞行为和肌动蛋白定位使用荧光共焦时间推移显微镜。

Abstract

斑马鱼是一种理想的模型成像细胞在体内发育过程中的行为。斑马鱼的胚胎是外部受精，因而很容易在发展的各个阶段。此外，他们的光学清晰度，可在自然环境完整的胚胎细胞和分子动力学的高分辨率成像。我们使用的是一种实时成像方法，分析在神经嵴细胞迁移和神经轴突的生长和指导细胞的行为。

实时成像是了解调节细胞运动过程的机制，特别有用。要前伸活动和分子动力学，细胞运动的细节，如可视化，这是有利的标签单个细胞。在斑马鱼，质粒DNA注入产生一个短暂的马赛克的表达模式，并提供比其它细胞标记方法明显的好处。例如，转基因株系往往标签整个细胞群，从而有可能掩盖在一个单元格（或分子分布的变化）的罚款突起可视化。此外，在单细胞阶段的DNA注射，创伤小，更精确比染料注射在稍后阶段。

在这里，我们描述一个标签个别发展中国家的神经元或神经嵴细胞，其在体内的行为成像的方法。我们注入1 - 细胞期胚胎，结果马赛克转基因表达质粒DNA。载体含有细胞特异性启动子驱动的感觉神经元或神经嵴细胞的一个子集的兴趣的基因表达。我们提供膜有针对性的GFP标记的细胞或生物传感器探头，允许在活细胞¹的F -肌动蛋白的可视化的例子。

埃里卡Namrata Asuri，安德森，和马修粘土贡献同样对这项工作。

Protocol

1。大会注射的幻灯片和影像幻灯片

注射用幻灯片：

1. 根据制造商的指示准备Sylgard有机硅弹性体。
2. 使用Sylgard债券三个标准玻璃显微镜幻灯片一起堆放其他两个幻灯片，这是安排在长边侧端的交集上一张幻灯片。顶部的幻灯片创建一个直角的角落或“墙”之间的顶部和底部的幻灯片。
3. 让Sylgard设置过夜。这些幻灯片是可重复使用的的。

影像幻灯片：

1. 我们用一个标准的玻璃显微镜幻灯片（75毫米x 25毫米x 1毫米）大小相同的矩形不锈钢切，使商会适合显微镜舞台上的幻灯片持有人。切一个1.5厘米的洞是在矩形的中心。
2. 贴上22毫米²盖玻片Sylgard金属矩形。使用刚好够Sylgard彻底封盖玻片。倒置显微镜上的形象，胚胎将被安装在此盖玻片，并从底部成像。
3. 让Sylgard设置过夜。这些幻灯片是可重复使用的的和70％之间使用乙醇清洗。

2。制备的DNA结构

为了表达组织特异性的方式在的基因，感兴趣的基因被克隆背后的细胞特异性启动子。我们使用的斑马鱼neurogenin1的基因（ - 3.1ngn1）的顺式^调控元件 2或SOX10基因（- ^4.9sox10）3驱动器中的感觉神经元或神经嵴细胞的表达，分别。细胞和膜的动态可视化，我们对此表示细胞质或本地化膜荧光团。形象F -肌动蛋白的分布，我们表示融合mCherry（UtrCH mCherry）utrophin调宁蛋白同源结构域的DNA编码。 UtrCH mCherry传感器探头允许在不干扰与肌动蛋白动力学^1，F -肌动蛋白的可视化。我们生成这些DNA的结构重组基于克隆策略^4，在斑马鱼Tol2kit ⁵向量使用Invitrogen公司的网关。

1. 生成表达载体（S），使用多站点网关技术和向量从斑马鱼^Tol2kit 5 。质粒含有pT2KXIGDin Tol2骨干。
2. QIAfilter密准备质粒试剂盒（QIAGEN公司），并在无菌水洗脱纯化的质粒DNA。 DNA并不需要注射线性。

3。注射DNA的结构

1. 稀释的DNA的10-50微克/毫升的DNA终浓度为0.2％酚红水（在注射过程中的可视化）。
2. 填充和校准针：回填约1μLDNA溶液一把拉住毛细管针插入持针注射器具（我们使用一个Picospritzer）。用细镊子，打破关闭针尖端张开，大约是10毫米直径的尖端。测量的矿物油与目镜测微计液滴的直径。调整压力持续时间设置，以获得约1 NL体积的液滴。
3. 在E3胚胎培养基（5mm的氯化钠，氯化钾0.17mM，0.33mM _氯化钙 ，0.33mM硫酸镁₄ * 7H _{2 O，pH}值7.0），收集1 -细胞阶段的胚胎。
4. 约30-60胚胎转移到注射幻灯片在角落的顶部和底部的幻灯片之间形成合适的角度和位置胚胎。删除的大部分表面张力的幻灯片，使胚胎举行的E3。
5. 用解剖针弯曲旋转胚胎细胞，所以对注射幻灯片的墙上。
6. 使用显微操作针，通过蛋黄和成单细胞胚胎，通过胚胎绒毛膜引导。注入0.5-1 NL进入细胞内的DNA溶液。
7. 转移到培养皿在E3和孵化的胚胎在28.5 ° C。如果有必要，可以放慢发展，在较低温度下进行孵化的胚胎。

4。成像安装胚胎

1. 约一个小时，用细镊子胚胎取出chorions前胚胎达到成像（受精后约14-17小时，我们的目的）所需的年龄。
2. 选择与使用解剖显微镜配备荧光标记的细胞胚胎。我们使用尼康AZ100，因为它的工作距离长和高放大倍率的组合范围的4倍的目标（40X放大倍率）。
3. 胚胎放入一个离心管中，约50μL的E3含0.2％Tricaine麻醉（10X浓度）。
4. 10毫米HEPES（保持在42 ° C）稀释Tricaine终浓度为0.02％，添加500μL的1％，在E3低熔点琼脂糖。
5. 立即转移到琼脂糖下降的胚胎使用大口径玻璃吸管的成像幻灯片的盖玻片。
6. 琼脂糖变硬之前，胚胎的位置，所以对底部的盖玻片（神经嵴细胞和背侧脊髓感觉神经元下降的背下来）标记细胞的地区面临。
7. 组装成像室：外套一个塑料环与硅真空润滑脂，并加盖金属成像幻灯片（外直径2厘米，3毫米高）的一方。大衣环的另一端与油脂。
8. 填写E3含10毫米的HEPES和0.02％Tricaine室。顶端脂环表面贴上22毫米²盖玻片密封腔顶部。

5。 4D成像IX81显微镜奥林巴斯FV1000共聚焦细胞行为

图像采集的细节将取决于你的显微镜系统的细节。在这里，我们描述奥林巴斯FV1000共聚焦显微镜的收购过程中的时间推移。看到以前的朱庇特的时间推移收购协议蔡司LSM 510共聚焦系统^6。

1. 将幻灯片固定在显微镜舞台上的成像室，并专注于使用透射光下一个10X或20X的目标胚胎。
2. 切换到一个60X的目标（1.2​​或更高的NA）和重点标记的细胞与epifluorescence。我们使用的油浸（1.35 NA 60xO UPLSAPO）或用水浸泡（1.20 NA 60xW UPLSAPO）镜头。
3. 在FV软件（版本1.7c），单击在XY重复开始激光扫描。
4. 调整收购设置和图像采集控制激光输出，扫描速度，高压，增益和偏移水平，优化信号，同时保持在最低水平（25％或更低）激光功率，以防止组织损伤和减少漂白。
5. 为了获得一个Z系列，Z - Stack的上限和下限，随着步长。确保从事深度图标，XY扫描图标的XY和Z突出。通过点击的XYZ扫描图标，开始收购。
6. 为了获得一个时间推移系列，TimeScan标题下，在采集设置“窗口设置的时间间隔的时间点和数量。图像采集控制窗口中点击时间图标，使XY扫描图标的XY（Z）和T突出。按一下XY（Z）T扫描图标，开始收购。
7. 另外，TimeController可用于建立一个时间推移。此编程生成大型数据集时非常有用，因为它不超过内存分配。在“设备”下，打开TimeController窗口。创建一个新的成像任务。图像参数“窗口将打开。点击FV状态“按钮，更新采集设置。确保保存和删除终止标题下检查。设置输出文件的名称，并单击“确定”以保存设置并关闭窗口。使用循环功能设置所需的时间间隔和时间点。单击“准备”，并开始着手收购。暂停和Z型转向功能可用于重新调整，而成像。

6。代表性的成果

数字和电影描绘的膜有针对性的荧光基团或肌动蛋白的生物传感器探头标记的感觉神经元和神经嵴细胞的例子。

图1共聚焦显微镜图像一个TG（ngn1：GFP - caax）（Z -预测）：mCherry - caax DNA的转基因胚胎注入25 PG ngn1。 mCherry - CAAX标签的所有标记Rohon胡子感觉神经元的背景下一个神经元红 （ 一）绿色（B）C）的绿色和红色通道的合并图像。比例尺= 50微米。

图2共焦Z -〜20 PG ngn1注入胚胎中的神经元 ： 预测 。mCherry - UtrCH DNA）Rohon胡子在16.5 HPF胚胎感觉神经元。 F -肌动蛋白的信号强度在生长锥（箭头）和二）在20 HPF胚胎神经元表现出强大的F - actin的信号在支周围神经轴突（箭头）和较弱的信号在较为成熟的中央生长锥沿新形成的神经轴突的突起。轴突（箭头）。比例尺= 50微米。

Discussion

注入的DNA的最佳浓度会有所不同规模和实力的推动者而兴建，并应凭经验确定。太多的DNA注射剂可能会导致不健康的胚胎具有广泛的细胞死亡，而太少会导致表达转基因注入胚胎的比例很小。 DNA的表达水平的荧光信号，从细胞到细胞的不同强度相关。在epifluorescence胚胎排序时，排除那些与表达非常高的水平。显得非常明亮的标记的细胞，通常也显示出明显的迹象，如细胞形态异常，标签分子mislocalization，和细胞死亡的毒性。典型的DNA注入产生的胚胎，适合成像的5-10％。

F -肌动蛋白的生物传感器可以在高水平表达时，在显性负时尚功能。如果启动子驱动的表达是有问题的的，该传感器可通过注射基因表达无所不在。基因注射的优点是可以通过调节mRNA的浓度控制的表达水平。这些胚胎的单个细胞合作注入的DNA标记，构建含有一种细胞特异性启动子的本地化的一种膜荧光团的驾驶表达。我们已经用这种方法对图像F -肌动蛋白在神经嵴细胞^7。

我们经常开展单细胞标记技术在转基因的表达行。例如，注入了3.1ngn1：mcherry成胚胎的 TG质粒（3.1ngn1：GFP）线将标签个人在一个绿色的神经元背景的红色的感觉神经元。这个策略允许在整个细胞群中的单个细胞的行为的检查。

我们这里重点成像神经元和神经嵴细胞的行为和肌动蛋白分布。然而，组织的特定的马赛克DNA质粒注射细胞标记的一般方法，可以扩大使用荧光融合蛋白，以及其他基因编码的生物传感器探头。结合这些技术可以让研究人员进行可视化的特定分子的亚细胞定位以及在体内的信号传导机制。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	A5040-250G
Sylgard Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184
QIAfilter Plasmid Midi Kit	Qiagen	12243
Low melting point agarose	Invitrogen	15517-014
Picospritzer	Parker Hannifin Corporation	051-0302-900