Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d'actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

Summary

Ce protocole décrit l'imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.

Abstract

Le poisson zèbre est un modèle idéal pour les comportements d'imagerie cellulaire pendant le développement in vivo. Embryons de poisson zèbre sont fécondés à l'extérieur et donc facilement accessible à toutes les étapes de développement. En outre, leur clarté optique permet d'imagerie à haute résolution de la cellule et de la dynamique moléculaire dans le milieu naturel de l'embryon intact. Nous utilisons une approche d'imagerie en direct à analyser les comportements lors de la migration des cellules de crête neurale de cellules et de l'excroissance et l'orientation des axones neuronaux.

Imagerie Live est particulièrement utile pour comprendre les mécanismes qui régulent les processus motilité cellulaire. Pour visualiser les détails de la motilité cellulaire, comme l'activité de propulsion et de dynamique moléculaire, il est avantageux de marquer des cellules individuelles. Dans le poisson zèbre, l'injection d'ADN plasmidique donne une mosaïque d'expression transitoire et offre des avantages distincts par rapport aux autres méthodes de marquage des cellules. Par exemple, des lignées transgéniques qualifient souvent les populations de cellules entières et peuvent donc occulter la visualisation des saillies fines (ou des changements dans la distribution moléculaire) dans une seule cellule. En outre, l'injection de l'ADN au stade d'une cellule est moins invasive et plus précise que les injections de teinture à des stades ultérieurs.

Nous décrivons ici une méthode pour l'étiquetage individuel des neurones en développement ou les cellules de la crête neurale et l'imagerie par leur comportement in vivo. Nous injectons ADN plasmidique dans une cellule embryons au stade, qui se traduit par l'expression du transgène mosaïque. Les vecteurs contiennent des cellules de promoteurs spécifiques de cette expression d'entraînement d'un gène d'intérêt dans un sous-ensemble de neurones sensoriels ou des cellules de la crête neurale. Nous fournissons des exemples de cellules marquées à la GFP membrane cible ou avec une sonde biocapteur qui permet la visualisation de la F-actine dans les cellules vivantes ^1.

Erica Andersen, Namrata Asuri, et Matthew Clay ont contribué également à ce travail.

Protocol

1. Assemblée des diapositives et des diapositives d'injection d'imagerie

Diapositives d'injection:

1. Préparer élastomère de silicone Sylgard conformément aux instructions du fabricant.
2. Utilisez le Sylgard d'obligations à trois microscope en verre standard de diapositives ainsi que par l'empilement d'une diapositive sur le dessus de l'intersection des deux autres diapositives, qui sont disposés côte à côte sur les bords longs. Le chariot supérieur crée un angle droit ou de "mur" entre le haut et glisse en bas.
3. Laissez Sylgard mis nuit. Ces lames sont réutilisables.

Diapositives d'imagerie:

1. Nous utilisons des rectangles d'acier inoxydable coupées à la même taille d'une lame de microscope en verre standard (75mm x 25mm x 1mm) pour la chambre s'adapte le support de diapositives sur la platine du microscope. Un trou de 1,5 cm est coupé dans le centre du rectangle.
2. Apposez une lamelle de 22 mm ² au rectangle en métal avec Sylgard. Utilisez juste assez pour bien sceller Sylgard la lamelle. Pour l'image sur un microscope inversé, les embryons seront montés sur cette lamelle et imagée à partir du bas.
3. Laissez Sylgard mis nuit. Ces lames sont réutilisables et nettoyé avec de l'éthanol à 70% entre les utilisations.

2. Préparation de constructions d'ADN

Pour exprimer un transgène dans un tissu de manière spécifique, le gène d'intérêt est cloné derrière un promoteur spécifique des cellules. Nous utilisons un élément cis-régulatrices du gène de poisson zèbre neurogenin1 (-3.1ngn1) ² ou le gène sox10 (-4.9sox10) ³ pour conduire l'expression dans les neurones sensoriels ou des cellules de la crête neurale, respectivement. Pour visualiser la dynamique cellulaire et la membrane, nous exprimons cytoplasmiques ou membranaires localisées fluorophores. Pour l'image de F-actine de distribution, nous exprimons l'ADN codant pour le domaine d'homologie calponine de l'utrophine fusionnée à mCherry (UtrCH-mCherry). La sonde UtrCH-mCherry biocapteur permet la visualisation de la F-actine, sans interférer avec la dynamique de l'actine ^1. Nous générer ces constructions d'ADN en utilisant la passerelle Invitrogen recombinaison stratégie basée sur le clonage et les vecteurs de ⁴ fournie dans le poisson zèbre Tol2kit ^5.

1. Générer vecteur d'expression (s) en utilisant multisite-passerelle de la technologie et des vecteurs de la Tol2kit zebrafish ^5. Les plasmides contenant l'épine dorsale du Tol2 pT2KXIGDin.
2. Purifier l'ADN plasmidique avec QIAfilter Plasmid Midi Kit de préparation (QIAGEN Inc) et éluer à l'eau stérile. L'ADN n'a pas besoin d'être linéarisé pour l'injection.

3. L'injection de constructions d'ADN

1. Diluer l'ADN à une concentration finale de 10-50 pg / ml d'ADN dans le rouge de phénol à 0,2% (pour la visualisation lors de l'injection) dans l'eau.
2. Remplir et calibrer l'aiguille: Retour de remplissage d'une aiguille tiré capillaire avec environ 1 ul solution d'ADN et de l'insérer dans le porte-aiguille de l'appareil d'injection (nous utilisons un Picospritzer). En utilisant une pince fine, casser la pointe de l'aiguille de telle sorte que l'ouverture pointe est d'environ 10 mm de diamètre. Mesurer le diamètre de la gouttelette dans l'huile minérale avec un micromètre oculaire. Ajustez le réglage durée de la pression pour obtenir une goutte d'environ 1 volume nl.
3. Recueillir une cellule embryons au stade d'embryon dans le milieu de l'E3 (5mm de NaCl, KCl 0.17mm, 0.33mm CaCl _2, MgSO ₄ * 0.33mm 7H ₂ O, pH 7,0).
4. Transfert environ 30-60 embryons à la diapositive d'injection et la position de l'embryon dans le coin à angle droit formé entre le haut et glisse en bas. Enlever la plupart de l'E3 pour que les embryons sont tenues à la diapositive par tension superficielle.
5. Utilisez une épingle pliée disséquer pour faire tourner des embryons afin que la cellule est contre le mur de la lame d'injection.
6. Utilisez un micromanipulateur pour guider l'aiguille à travers le chorion embryon, à travers le jaune d'œuf et dans la seule cellule de l'embryon. Injecter 0.5 à 1 solution d'ADN nl dans la cellule.
7. Transfert des embryons en boîtes de Petri en E3 et incuber à 28,5 ° C. Si nécessaire, le développement peut être ralenti par l'incubation des embryons à plus basse température.

4. Embryons de montage pour l'imagerie

1. Retirez le chorions des embryons avec des pinces fines environ une heure avant embryons atteignent l'âge souhaité pour l'imagerie (environ 14-17 heures après la fécondation pour nos fins).
2. Sélectionnez embryons avec des cellules marquées à l'aide d'un microscope de dissection équipés de fluorescence. Nous utilisons un objectif 4X (grossissement 40X) sur un champ de Nikon AZ100 en raison de sa combinaison de longue distance de travail et de grossissement élevé.
3. Placer un embryon dans un tube de micro avec environ 50 E3 ul contenant 0,2% de tricaïne anesthésiques (concentration 10X).
4. Ajouter 500 ul de 1% d'agarose bas point de fusion de l'E3 avec 10 mM HEPES (maintenue à 42 ° C), diluer la tricaïne à une concentration finale de 0,02%.
5. Immédiatement transférer l'embryon dans une goutte d'agarose à l'lamelle de la lame d'imagerie utilisant une pipette en verre grand diamètre.
6. Avant l'agarose se durcit, la position de l'embryon ainsi la région avec des cellules marquées est orientée vers le bas contre la lamelle du bas (bas dorsale pour les cellules de la crête neurale et dorsolatéral bas pour les neurones sensoriels spinaux).
7. Assemblez la chambre d'imagerie: Manteau d'un côté d'un anneau en plastique (2 cm de diamètre extérieur, 3 mm de haut) avec de la graisse de silicone sous vide et d'apposer à la diapositive imagerie métal. Manteau de l'autre côté de l'anneau avec de la graisse.
8. Remplir la chambre avec E3 contenant 10 mM d'HEPES et 0,02% tricaïne. Joint au sommet de chambre par l'apposition d'une lamelle de 22 mm ² à la surface supérieure de l'anneau graissé.

5. L'imagerie 4D des comportements cellulaires sur l'Olympe FV1000 confocale avec IX81 Microscope

Les détails de l'acquisition d'image dépendra des spécificités de votre système de microscope. Nous décrivons ici le processus d'acquisition time-lapse pour l'Olympus FV1000 microscope confocal. Voir le précédent protocole JoVE des time-lapse d'acquisition avec le Zeiss LSM 510 système confocal ^6.

1. Placez la chambre d'imagerie dans le support de diapositives sur la platine du microscope et de se concentrer sur l'embryon en utilisant un objectif 10x ou 20x en lumière transmise.
2. Basculer vers un objectif 60x (NA de 1,2 ou plus) et se concentrer sur la cellule étiquetés avec épifluorescence. Nous utilisons soit une immersion dans l'huile (UPLSAPO 60xO NA 1,35) ou de l'eau par immersion (UPLSAPO 60xW NA 1,20) lentille.
3. Dans le logiciel de FV (Ver 1.7c), cliquez sur répétez XY pour commencer le balayage laser.
4. Réglez les paramètres d'acquisition et de contrôle d'acquisition d'image (sortie de laser, la vitesse de balayage, HV, le gain, et les niveaux de décalage) pour optimiser le signal tout en gardant la puissance du laser à un minimum (25% ou moins) pour éviter d'endommager les tissus et réduire photoblanchiment.
5. Afin d'acquérir une série Z, définir les limites supérieure et inférieure de la Z-stack, avec la taille du pas. Assurez-vous que l'icône de profondeur est engagée afin que l'icône de balayage XY XY et Z a mis en évidence. Démarrer l'acquisition en cliquant sur l'icône de balayage XYZ.
6. Afin d'acquérir une série time-lapse, définissez l'intervalle de temps et le nombre de points dans le temps sous la rubrique TimeScan dans l'acquisition des paramètres de la fenêtre. Cliquez sur l'icône temps dans la fenêtre de contrôle Image Acquisition de telle sorte que l'icône de balayage XY a XY (Z) et T en surbrillance. Démarrer l'acquisition en cliquant sur le XY (Z) l'icône T Sweep.
7. Alternativement, le TimeController peut être utilisé pour mettre en place un time-lapse. Cette programmation est utile pour générer des ensembles de données volumineux, comme elle ne dépasse pas l'allocation de mémoire. Sous Périphérique, ouvrez la fenêtre TimeController. Créer une tâche d'imagerie. La fenêtre des paramètres d'image s'ouvre. Cliquez sur le bouton Etat FV à jour les paramètres d'acquisition. Assurez-vous Enregistrer et Supprimer sont vérifiés sous la rubrique Terminer. Définir le nom du fichier de sortie et cliquez sur OK pour enregistrer les paramètres et fermer la fenêtre. Utilisez la fonction de boucle pour définir l'intervalle de temps souhaité et le nombre de points dans le temps. Cliquez Ready et Start pour commencer l'acquisition. La pause et le Z-fonctions de changement peut être utilisé pour recentrer tout d'imagerie.

6. Les résultats représentatifs

Les chiffres et les films représentent des exemples de neurones sensoriels et les cellules de la crête neurale étiquetés avec une membrane cible fluorophores ou la sonde biocapteur actine.

Figure 1 images confocal (z-projections) de Tg (ngn1: GFP-CAAX). Embryon transgénique injectées avec 25 pg ngn1: mCherry-CAAX ADN. Les étiquettes mCherry-CAAX un neurone rouge (A) dans un fond avec tous les neurones sensoriels ROHON Barbe-étiquetés verts (B). C) image fusionnée des canaux vert et rouge. Barre d'échelle = 50 microns.

Figure 2 confocale z-projections des neurones dans les embryons injectés avec ~ 20 pg ngn1:.. MCherry-UtrCH ADN A) ROHON Barbe-neurone sensoriel dans 16,5 embryons HPF. F-actine du signal est forte dans les cônes de croissance (flèches) et en saillies le long des axones nouvellement formé. B) Neuron dans 20 embryons HPF montrant une forte F-actine du signal dans les cônes de croissance de l'axone périphériques branchés (pointes de flèches) et signal plus faible dans le centre plus mature axones (flèches). Barre d'échelle = 50 microns.

Discussion

La concentration optimale de l'ADN injecté varie selon la taille et la force du promoteur de construire et doit être déterminée empiriquement. L'injection d'ADN trop peut conduire à des embryons malsaine avec la mort cellulaire étendue, tandis que trop peu se traduira par une très faible proportion des embryons injectés exprimant le transgène. Le niveau d'expression d'ADN est corrélée avec la force du signal fluorophore, qui varie de cellule à cellule. Alors que le tri des embryons en épifluorescence, exclure ceux qui ont des niveaux extrêmement élevés d'expression. Les cellules marquées qui apparaissent très lumineux en général montrent également des signes évidents de toxicité, tels que la morphologie des cellules anormales, mauvaise localisation des molécules marquées, et la mort cellulaire. Une injection d'ADN typique des rendements de 5-10% des embryons qui sont adaptés à l'imagerie.

Le biocapteur F-actine peut fonctionner dans un mode dominant négatif lorsqu'il est exprimé à des niveaux élevés. Si le promoteur axée expression est problématique, le biocapteur peut être exprimé de façon ubiquitaire par l'injection d'ARNm. L'avantage de l'injection de l'ARNm est que les niveaux d'expression peut être contrôlée en ajustant la concentration de l'ARNm. Cellules individuelles dans ces embryons sont étiquetés par la co-injection d'un ADN chimère contenant une expression spécifique des cellules promoteur de conduite d'un fluorophore membrane localisée. Nous avons utilisé cette approche pour l'image de F-actine dans les cellules de la crête neurale ^7.

Nous avons souvent effectuer la technique de marquage unique cellule dans les rides d'expression transgénique. Par exemple, l'injection d'un-3.1ngn1: mcherry plasmide dans des embryons de la Tg (-3.1ngn1: GFP) en ligne sera étiquette individuelle des neurones sensoriels rouge dans un contexte de neurones vert. Cette stratégie permet d'examiner le comportement d'une cellule individuelle dans le contexte de la population de cellules entières.

Nous nous concentrons ici sur l'imagerie neuronale et neurales des comportements cellules de la crête et la distribution d'actine. Cependant, la méthode générale du tissu cellulaire mosaïque étiquetage spécifique par injection d'ADN plasmidique peut être étendu pour une utilisation avec des protéines de fusion fluorescentes ainsi que d'autres codées génétiquement sondes biocapteur. En combinant ces techniques peuvent permettre aux chercheurs de visualiser la localisation subcellulaire de molécules spécifiques ainsi que des mécanismes de signalisation in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	A5040-250G
Sylgard Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184
QIAfilter Plasmid Midi Kit	Qiagen	12243
Low melting point agarose	Invitrogen	15517-014
Picospritzer	Parker Hannifin Corporation	051-0302-900