Summary
פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.
Abstract
דג הזברה הוא מודל אידיאלי עבור תא התנהגויות הדמיה במהלך פיתוח in vivo. עוברי דג הזברה הם מופרית חיצונית ולכן נגיש בכל שלבי הפיתוח. יתר על כן, בהירות אופטית שלהם מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים של דינאמיקה מולקולארית בסביבה הטבעית של העובר ללא פגע. אנחנו משתמשים בגישה הדמיה לחיות כדי לנתח את התנהגות התא במהלך נדידת תאים עצביים לפסגה ואת תולדה והכוונה של אקסונים העצבית.
הדמיה חיה שימושית במיוחד להבנת המנגנונים המווסתים תהליכים תנועתיות התא. כדי להמחיש את הפרטים של תנועתיות התא, כגון פעילות ובולטות ודינמיקה מולקולרית, זה יתרון תווית תאים בודדים. בשנת דג הזברה, הזרקת פלסמיד דנ"א התשואות דפוס חולף ביטוי פסיפס מציע יתרונות ברורים על פני שיטות אחרות תיוג התא. לדוגמה, קווי מהונדס לעתים קרובות התווית אוכלוסיות תאים שלמים ובכך עלול לטשטש להדמיה של בליטות קנס (או שינויים בחלוקת מולקולרית) בתא בודד. בנוסף, הזרקה של ה-DNA בשלב אחד התא הוא פחות פולשני ומדויק יותר זריקות צבע בשלבים מאוחרים יותר.
כאן אנו מתארים את שיטת תיוג לפתח נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי הדמיה התנהגותם in vivo. אנו מזריקים פלסמיד דנ"א לתוך 1-תא הבמה עוברי, שתוצאתה ביטוי transgene פסיפס. וקטורים מכילים תאים ספציפיים היזמים כי כונן הביטוי של הגן של עניין משנה של עצב סנסורי או תאים הרכס העצבי. אנו מספקים דוגמאות של תאים שכותרתו עם GFP קרום ממוקד או עם בדיקה biosensor המאפשרת ויזואליזציה של אקטין-F בתאים חיים 1.
אריקה אנדרסן, Namrata Asuri, ומתיו קליי תרם לא פחות לעבודה זו.
Protocol
1. האסיפה של שקופיות הזרקת ומחליק הדמיה
הזרקת שקופיות:
- הכן אלסטומר Sylgard סיליקון בהתאם להוראות היצרן.
- השתמש במיקרוסקופ כדי Sylgard three זכוכית האג"ח תקן שקופיות ביחד ידי הערמה שקופית אחת על גבי בצומת של שתי שקופיות אחרות, אשר מסודרים Side-by-הצד בקצוות ארוכים. השקופית העליונה יוצר פינה ישר זווית או "קיר" בין החלק העליון ומחליק למטה.
- בואו Sylgard להגדיר לילה. שקופיות אלו לשימוש חוזר.
הדמיה שקופיות:
- אנו משתמשים מלבנים נירוסטה לחתוך לגודל זהה של שקופיות מיקרוסקופ רגיל זכוכית (75mm X 25mm X 1 מ"מ), כך החדר מתאים לבעל להחליק על הבמה מיקרוסקופ. חור 1.5 ס"מ הוא חתך במרכז המלבן.
- להצמיד 22 2 מ"מ coverslip אל מלבן מתכת עם Sylgard. השתמש מספיק Sylgard ביסודיות החותם coverslip. כדי התמונה על מיקרוסקופ הפוכה, עוברים יהיה רכוב על coverslip זה צילמו מלמטה.
- בואו Sylgard להגדיר לילה. שקופיות אלו לשימוש חוזר וניקה עם אתנול 70% בין השימושים.
2. הכנת בונה DNA
כדי להביע transgene באופן רקמות ספציפיות, הגן של עניין הוא משובטים מאחורי האמרגן תא ספציפי. אנו משתמשים אלמנט cis-הרגולציה של הגן דג הזברה neurogenin1 (-3.1ngn1) 2 או את הגן sox10 (-4.9sox10) 3 לנהוג ביטוי עצב סנסורי או תאים הרכס העצבי, בהתאמה. כדי להמחיש את הדינמיקה קרום התא, אנו מביעים cytoplasmic או קרום מקומי fluorophores. כדי חלוקת התמונה F-אקטין, אנו מביעים את ה-DNA המקודד את תחום הומולוגיה calponin של utrophin התמזגו mCherry (UtrCH-mCherry). החללית UtrCH-mCherry biosensor מאפשר הדמיה של אקטין-F מבלי להפריע אקטין דינמיקה 1. אנו מייצרים אלה DNA בונה באמצעות Gateway Invitrogen רקומבינציה מבוססי אסטרטגיה שיבוט 4 ו וקטורים הניתנים Tol2kit דג הזברה 5.
- יצירת וקטור הביטוי (ים) באמצעות multisite-Gateway טכנולוגיה וקטורים מן Tol2kit דג הזברה 5. פלסמידים מכילים את עמוד השדרה Tol2 מ pT2KXIGDin.
- לטהר DNA פלסמיד פלסמיד עם QIAfilter Midi ערכת הכנה (QIAGEN Inc) ו elute במים סטריליים. ה-DNA לא צריך להיות לינארית להזרקה.
3. הזרקת בונה DNA
- לדלל את ריכוז הדנ"א סופי של ה-DNA מיקרוגרם / מ"ל 10-50 באדום פנול 0.2% (עבור להדמיה במהלך ההזרקה) במים.
- מילוי לכייל מחט: חזרה מילוי מחט נימי משך כ 1 עם פתרון ה-DNA μl והכנס אותו לתוך מחזיק מחט של מנגנון הזרקה (אנו משתמשים Picospritzer). בעזרת מלקחיים בסדר, לשבור את קצה המחט כך הפתיחה טיפ הוא כ 10 מ"מ קוטר. מדוד את הקוטר של אגל של שמן מינרלי עם מיקרומטר עינית. התאם את משך הגדרה לחץ כדי לקבל טיפה של נפח nl כ 1.
- איסוף 1 תאים בשלב עוברי במדיום העובר E3 (NaCl 5mm, 0.17mM KCl, 0.33mM CaCl 2, 0.33mM MgSO 4 * 7H 2 O, ה-pH 7.0).
- העברת כ 30-60 עוברים לשקופית הזרקת עמדת עוברים בפינת זווית ישרה שנוצר בין החלק העליון שקופיות התחתונה. הסר ביותר של E3, כך עוברים מוחזקים לשקופית על ידי מתח הפנים.
- השתמש סיכה לנתח התכופפה כדי לסובב עוברים כל כך התא על הקיר של השקופית ההזרקה.
- השתמש micromanipulator להנחות את המחט דרך סיסית את העובר, דרך החלמון לתוך תא בודד של העובר. להזריק 0.5-1 פתרון nl דנ"א לתוך התא.
- מעבירים את העוברים לתוך צלחות פטרי ב-E3 ו לדגור על 28.5 ° C. אם יש צורך, פיתוח יכול להיות האטה על ידי דוגרים העוברים בטמפרטורה נמוכה יותר.
4. עוברים הרכבה הדמיה
- הסר את chorions מן העוברים עם מלקחיים בסדר כשעה לפני העוברים מגיעים לגיל הרצוי עבור הדמיה (כ 14-17 שעות לאחר ההפריה לענייננו).
- בחר עוברים עם תאים שכותרתו באמצעות מיקרוסקופ המצויד לנתח פלואורסצנטי. אנו משתמשים אובייקטיבי 4X (בהגדלה 40X) על היקף Nikon AZ100 בשל השילוב של מרחק עבודה ארוך בהגדלה גבוהה.
- המקום עובר לתוך צינור microfuge עם כ 50 E3 μl המכיל 0.2% Tricaine הרדמה (ריכוז 10X).
- הוסף 500 μl 1% נקודת התכה נמוכה agarose ב-E3 עם 10 HEPES מ"מ (שמרו על 42 מעלות צלזיוס), דילול Tricaine לריכוז סופי של 0.02%.
- מיד להעביר את העובר לירידה agarose לcoverslip של השקופית הדמיה בעזרת פיפטה זכוכית רחב משעמם.
- לפני agarose מתקשה, מקם את העובר כל כך את האזור עם תאים שכותרתו היא פונה כלפי מטה נגד coverslip התחתון (ירידה של הגב בתאי הרכס העצבי ואת דורסולטרלי למטה עצב סנסורי השדרה).
- הרכב חדר הדמיה: שכבה אחת בצד של טבעת פלסטיק (2 ס"מ קוטר חיצוני, 3 מ"מ) עם גריז סיליקון ואקום לצרף לשקופית הדמיה מתכת. סמל בצד השני של הטבעת עם גריז.
- ממלאים את החדר עם E3 המכיל 10 HEPES מ"מ Tricaine 0.02%. חותם העליון קאמרית ידי הדבקת 2 coverslip 22 מ"מ על פני השטח משומנת העליון של הטבעת.
5. 4D הדמיה של התנהגויות תא באולימפוס FV1000 confocal עם מיקרוסקופ IX81
פרטי הרכישה של התמונה תהיה תלויה הפרטים של מערכת מיקרוסקופ שלך. כאן אנו מתארים את התהליך זמן לשגות עבור רכישת מיקרוסקופ אולימפוס FV1000 confocal. ראה פרוטוקול יופיטר הקודם עבור רכישת זמן לשגות עם מערכת LSM Zeiss confocal 510 6.
- הנח את תא הדמיה לתוך המחזק את השקופית על הבמה מיקרוסקופ ולהתמקד העובר באמצעות 10X או 20X אובייקטיבי תחת האור המועבר.
- עבור מטרה 60x (NA של 1.2 ומעלה) ולהתמקד תא שכותרתו עם epifluorescence. אנו משתמשים גם טבילה שמן (UPLSAPO 60xO NA 1.35) או טבילה במים (UPLSAPO 60xW NA 1.20) העדשה.
- ב התוכנה FV (Ver 1.7c), לחץ על חזור XY להתחיל סריקה לייזר.
- התאם את הגדרות הרכישה רכישת התמונה שולטת (פלט לייזר, מהירות סריקה, HV, עלייה, רמות אופסט) כדי לייעל את האות, תוך שמירה על כוח לייזר לפחות (25% או נמוך יותר) כדי למנוע נזק לרקמות ולהפחית photobleaching.
- כדי לרכוש Z-series, להגדיר את הגבולות העליונים והתחתונים של מחסנית-z, יחד עם גודל צעד. ודא כי סמל עומק עוסקת כך סמל טאטא XY יש XY ו-Z מודגשות. התחל רכישת ידי לחיצה על סמל טאטא XYZ.
- כדי לרכוש סדרה זמן לשגות, להגדיר את מרווח הזמן מספר נקודות זמן תחת הכותרת TimeScan בחלון רכישת הגדרות. לחץ על אייקון שעה חלון רכישת תמונה בקרת כך סמל טאטא XY יש XY (Z) ו-T מודגשות. התחל הרכישה על ידי לחיצה על (Z) XY סמל טאטא טי.
- לחלופין, TimeController ניתן להשתמש כדי להגדיר זמן לשגות. תכנות זו שימושית בעת יצירת ערכות נתונים גדולות, כפי שהוא, אינו עולה על הקצאת זיכרון. תחת התקן, לפתוח חלון TimeController. יצירת משימה דימות חדשה. חלון פרמטר התמונה יפתח. לחץ על לחצן מצב FV לעדכן הגדרות הרכישה. ודא שמור מחק נבדקים תחת הכותרת לסיים. הגדר שם של קובץ פלט ולחץ על אישור כדי לשמור את ההגדרות ולסגור את החלון. השתמש בפונקציה לולאה כדי להגדיר את מרווח הזמן הרצוי מספר נקודות זמן. לחץ על התחל מוכן להתחיל הרכישה. Pause ו-Z-Shift פונקציות ניתן להשתמש להתרכז בזמן הדמיה.
6. נציג תוצאות
הדמויות וסרטים מתארים דוגמאות של עצב סנסורי ותאי הרכס העצבי שכותרתו עם קרום במיקוד fluorophores או בדיקה biosensor אקטין.
איור 1 תמונות Confocal (z-תחזיות) של (ngn1: GFP-caax) Tg. העובר מהונדס הזריקו 25 pg ngn1: mCherry caax-DNA. MCherry-CAAX תוויות נוירון אחד אדום (א ') ברקע עם כל Rohon-בירד עצב סנסורי שכותרתו ירוק (B). C) תמונה ממוזגים של שני הערוצים ירוק ואדום. בר סולם = 50 מיקרומטר.
איור 2 Confocal Z-התחזיות של נוירונים עוברים הזריקו ~ 20 pg ngn1:.. MCherry UtrCH-DNA) Rohon-בירד נוירון חושי בעובר 16.5 hpf. F-אקטין האות חזק קונוסים צמיחה (ראשי חץ) והן בליטות לאורך אקסונים החדש שנוצר. B) Neuron בעובר 20 hpf מראה איתות חזק F-אקטין בחרוטים הצמיחה של האקסון היקפי קנים (ראשי חץ) ואת האות חלש במרכז בוגר יותר אקסונים (חיצים). בר סולם = 50 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הריכוז האופטימלי של ה-DNA מוזרק ישתנה בהתאם לגודל וכוח של האמרגן לבנות יש לקבוע באופן אמפירי. הזרקה של ה-DNA יותר מדי יכול להוביל עוברים בריאים עם מוות של תאים נרחב, בעוד מעט מדי תגרום חלק קטן מאוד של עוברים מוזרק המבטא את transgene. רמת ביטוי ה-DNA בקורלציה עם חוזק האות fluorophore, אשר משתנה מתא לתא. בעוד עוברים מיון לפי epifluorescence, להוציא אלו עם רמות גבוהות מאוד של הביטוי. תאים תווית שמופיעים בדרך כלל בהיר מאוד גם להראות סימנים ברורים של רעילות, כגון מורפולוגיה תאים נורמליים, mislocalization של מולקולות מתויג, ומוות התא. הזרקת DNA טיפוסי התשואות 5-10% של העוברים המתאימים הדמיה.
Biosensor F-אקטין יכול לתפקד באופן שלילי דומיננטי כאשר הביע ברמות גבוהות. אם מקדם מונחה הביטוי הוא בעייתי, biosensor יכול לבוא לידי ביטוי בכל מקום בגוף על ידי הזרקת mRNA. היתרון של הזרקת mRNA היא כי רמות הביטוי יכול להיות נשלט על ידי התאמת ריכוז ה-mRNA. תאים בודדים עוברים אלה מסומנים על ידי הזרקה משותף של ה-DNA מבנה המכיל תאים ספציפיים נהיגה האמרגן ביטוי fluorophore קרום מקומי. השתמשנו גישה זו התמונה F-אקטין בתאי הרכס העצבי 7.
לעתים קרובות אנו לבצע את הטכניקה תא בודד תיוג בקווים ביטוי מהונדס. לדוגמה, הזרקת-3.1ngn1: mcherry פלסמיד לעוברי של Tg (-3.1ngn1: GFP) קו יהיה תווית עצב סנסורי הפרט אדום ברקע של נוירונים ירוקים. אסטרטגיה זו מאפשרת בחינת התנהגותו של תא יחיד בתוך ההקשר של האוכלוסייה התא כולו.
אנו מתמקדים כאן על הדמיה עצביים עצבי תא לפסגה התנהגויות והפצה אקטין. עם זאת, השיטה הכללית של רקמות ספציפיות תיוג תא פסיפס בזריקה DNA פלסמיד ניתן להרחיב לשימוש עם חלבונים היתוך ניאון, כמו גם בדיקות אחרות biosensor מקודדים גנטית. שילוב של טכניקות אלה יכולים לאפשר לחוקרים לחזות לוקליזציה subcellular של מולקולות ספציפיות, כמו גם מנגנוני איתות in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 NS042228 ל MCH FV1000 אולימפוס confocal נרכשה עם מכשור NIH משותף מענק S10RR023717 את המחלקה לזואולוגיה באוניברסיטת וושינגטון (Bement לצרכן ביל).
אריקה אנדרסן, Namrata Asuri, ומתיו קליי תרם לא פחות נייר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | A5040-250G | |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12243 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Picospritzer | Parker Hannifin Corporation | 051-0302-900 |
References
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
