Bildproduktion för cell motilitet och Actin cytoskelettet av enskilda nervceller och neurala celler Crest i Zebrafish embryon

Summary

Detta protokoll beskriver avbildning av enskilda nervceller eller neurala celler crest i levande zebrafisk embryon. Denna metod används för att undersöka cellulära beteenden och aktin lokalisering med hjälp av fluorescens konfokala time-lapse mikroskopi.

Abstract

Den zebrafisk är en idealisk modell för beteenden avbildning celler under utvecklingen in vivo. Zebrafisk embryon externt befruktas och därmed lättillgänglig på alla stadier av utveckling. Dessutom tillåter deras optiska klarhet högupplösande avbildning av cell-och molekylär dynamik i den naturliga miljön för den intakta embryot. Vi använder ett levande avbildningsteknik att analysera celler beteenden under neural crest cell migration och utväxt och vägledning av neuronala axoner.

Bildproduktion är särskilt användbart för att förstå mekanismerna som reglerar processer cell motilitet. För att visualisera information om cell motilitet, såsom UTSTÅENDE aktivitet och molekylär dynamik, är det fördelaktigt att märka enskilda celler. I zebrafisk, ger plasmid DNA-injektion en övergående mönster mosaik uttryck och ger tydliga fördelar jämfört med andra metoder cell märkning. Till exempel transgena linjerna etikett oftast hela cellpopulationer och därmed kan dölja visualisering av böter utbuktningar (eller förändringar i molekylär distribution) i en enda cell. Dessutom är injektion av DNA i en cell steg mindre invasiv och mer exakt än dye injektioner i senare skeden.

Här beskriver vi en metod för märkning av enskilda utvecklingsländer nervceller eller neurala celler crest och bildhantering deras beteende in vivo. Vi injicera plasmid DNA i 1-cell embryon skede, vilket resulterar i mosaik transgenen uttryck. Vektorerna innehåller cell-specifika projektansvariga som driver uttrycket av en gen intresse för en delmängd av sensoriska neuroner och neurala celler krön. Vi ger exempel på celler märkta med membran riktade GFP eller med en biosensor sond som tillåter visualisering av F-aktin i levande celler ^1.

Erica Andersen, Namrata Asuri, och Matthew Clay bidragit lika för detta arbete.

Protocol

1. Montering av injektion diabilder och diabilder bildbehandling

Injektion diabilder:

1. Förbered Sylgard silikon elastomer enligt tillverkarens anvisningar.
2. Använd Sylgard till förbindelsen tre standardglas objektglas tillsammans genom att stapla en bild på toppen av skärningspunkten mellan de andra två bilderna, som ordnas sida vid sida på den långa kanterna. Den översta bilden skapar en rätvinklig hörnet eller "vägg" mellan toppen och botten diabilder.
3. Låt Sylgard in över natten. Dessa bilder kan återanvändas.

Imaging bild:

1. Vi använder rostfritt stål rektanglar klippa till samma storlek som en standard glas objektglas (75mm x 25mm x 1 mm) så kammaren passar diapositivhållaren på mikroskop scenen. En 1,5 cm hål skärs i mitten av rektangeln.
2. Fäst en 22 mm ² täckglas till metall rektangel med Sylgard. Använd bara tillräckligt Sylgard att grundligt täta täckglas. För bild på ett inverterat mikroskop, kommer embryon att monteras på denna täckglas och avbildat från botten.
3. Låt Sylgard in över natten. Dessa bilder är återanvändbara och rengörs med 70% etanol mellan användningarna.

2. Preparation av DNA konstruktioner

Att uttrycka en transgen i en vävnad-specifika sätt, är genen av intresse klonade bakom en-specifika promotorn. Vi använder en cis-reglerande element i zebrafisk neurogenin1 genen (-3.1ngn1) ² eller sox10 genen (-4.9sox10) ³ att köra uttryck i sensoriska neuroner och neurala celler crest, respektive. Att visualisera celler och membran dynamik, uttrycker vi cytoplasmisk eller membranstabiliserande lokaliserad fluoroforer. Att bilden F-aktin distribution, uttrycker vi DNA som kodar för calponin homologi domänen för utrophin smält till mCherry (UtrCH-mCherry). Den UtrCH-mCherry biosensor sond möjliggör visualisering av F-aktin utan att störa aktin dynamik ^1. Vi skapar dessa DNA-konstruktioner med Invitrogen Gateway rekombination-baserade kloning strategi ⁴ och vektorer ges i zebrafisk Tol2kit ^5.

1. Generera uttryck vektor (s) med Multisite-Gateway Technology och vektorer från zebrafisk Tol2kit ^5. Plasmider innehåller Tol2 ryggraden från pT2KXIGDin.
2. Rena plasmid DNA med QIAfilter Plasmid Midi Prep kit (QIAGEN Inc.) och eluera i sterilt vatten. DNA behöver inte vara linjär för injektion.

3. Injektion av DNA-konstruktioner

1. Späd DNA till en slutlig koncentration av 10-50 mikrogram / ml DNA hos 0,2% fenol rött (för visualisering under injektion) i vatten.
2. Fyll och kalibrera nål: Tillbaka fylla en drog kapillär nål med ca 1 l DNA-lösning och för in den i nålen innehavaren av injektion apparater (vi använder en Picospritzer). Med hjälp av en fin pincett, bryta spetsen av nålen så att spetsen öppningen är cirka 10 mm i diameter. Mät diametern på droppen i mineralolja med en okulär mikrometer. Justera inställningen tryck länge för att få en droppe på ca 1 nl volym.
3. Samla 1-cell embryon steg i E3 embryo medium (5mm NaCl, 0.17mM KCl, 0.33mM CaCl _2, 0.33mM MgSO ₄ * 7H ₂ O, pH 7,0).
4. Överför ca 30-60 embryon till injektionen bilden och placera embryon i rätt vinkel hörnet som bildas mellan toppen och botten diabilder. Ta bort de flesta av E3 så att embryon hålls till bilden av ytspänningen.
5. Använd en böjd dissekera stift att rotera embryon så cellen mot väggen av injektionen bilden.
6. Använd en mikromanipulator att styra nålen genom embryot chorion, genom äggula och in i enskild cell i embryot. Injicera 0,5-1 nl DNA-lösning in i cellen.
7. Överför embryon i petriskålar i E3 och inkubera vid 28,5 ° C. Vid behov kan utvecklingen bromsas genom att inkubera embryon vid lägre temperatur.

4. Montering embryon för bildbehandling

1. Ta bort chorions från embryon med fin pincett ungefär en timme innan embryon uppnå önskad ålder för avbildning (ungefär 14-17 timmar efter befruktning för våra ändamål).
2. Välj embryon med märkta celler med hjälp av en dissekera mikroskop utrustat med fluorescens. Vi använder en 4X mål (40X förstoring) på en Nikon AZ100 omfattning på grund av sin kombination av långa arbetsdagar avstånd och hög förstoring.
3. Placera ett embryo till ett mikrofugrör med ca 50 l E3 innehåller 0,2% Tricaine bedövning (10X koncentration).
4. Tillsätt 500 l 1% lägre agaros smältpunkten i E3 med 10 mM HEPES (förvaras vid 42 ° C), späda Tricaine till en slutlig koncentration av 0,02%.
5. Omgående överlåta embryo i ett agaros sjunka tilltäckglas för avbildning bilden med hjälp av ett stort hål glaspipett.
6. Innan agarosen hårdnar, placera embryot så att regionen med märkta celler är vänd nedåt mot botten täckglas (dorsala ner för neural crest celler och dorsolaterala ner för spinal sensoriska neuroner).
7. Montera avbildning kammare: Coat ena sidan av en plastring (2 cm yttre diameter, 3 mm höga) med silikon vakuum fett och anbringa på metallen avbildning bilden. Coat den andra sidan av ringen med fett.
8. Fyll kammaren med E3 innehållande 10 mM HEPES och 0,02% Tricaine. Täta hålrum genom att fästa en 22 mm ² täckglas till toppen smorda ytan av ringen.

5. 4D avbildning av celler beteenden på Olympus FV1000 konfokala med IX81 mikroskop

Detaljerna i bilden förvärvet beror på detaljerna i ditt mikroskop system. Här beskriver vi den tidsförlopp förvärvet process för Olympus FV1000 konfokalmikroskop. Se föregående JUPITER protokoll för tidsförlopp förvärvet med Zeiss LSM 510 konfokala systemet ^6.

1. Placera bildhantering kammaren i diapositivhållaren på mikroskop scenen och fokusera på ett embryo med hjälp av ett 10X eller 20X objektiv i ljus.
2. Byt till en 60X objektiv (NA på 1,2 eller högre) och fokus på märkta cell med epifluorescence. Vi använder antingen en oljeimmersion (UPLSAPO 60xO NA 1,35) eller vatten nedsänkning (UPLSAPO 60xW NA 1,20) lins.
3. I FV programvara (Ver 1.7c), klicka på XY upprepa att börja laserskanning.
4. Justera förvärv inställningar och bild kontroller förvärv (laserutskrifter, skanna hastighet, HV, förstärkning och offset nivåer) för att optimera signalen samtidigt lasereffekt minst (25% eller lägre) för att förhindra vävnadsskada och minska fotoblekning.
5. Att förvärva en Z-serie, som den övre och undre gränserna för z-stack, tillsammans med steg storlek. Se till att Djup ikonen är inkopplad så att XY icon har XY och Z markerat. Starta förvärv genom att klicka på XYZ icon.
6. Att förvärva ett tidsförlopp serien, ställa in tidsintervall och antal tidpunkter under TimeScan rubriken i förvärvet inställningar. Klicka på Time ikonen i Image Acquisition kontrollfönstret så att XY icon har XY (Z) och T markerat. Starta förvärv genom att klicka på XY (Z) T icon.
7. Alternativt kan TimeController användas för att inrätta en time-lapse. Detta program är användbart när generera stora datamängder, eftersom det inte överstiger minnesallokering. Enligt enhet öppnar TimeController fönster. Skapa en ny Imaging aktivitet. Bilden parameter öppnas. Klicka på FV status för att uppdatera förvärvet inställningar. Se Spara säker och Ta bort kontrolleras under Avsluta rubrik. Ställ utfilnamet och klicka på OK för att spara inställningarna och stänga fönstret. Använd Loop-funktionen för att ställa in önskat tidsintervall och antal tidpunkter. Klicka på Redo och Start för att börja förvärvet. Paus och Z-shift funktioner kan användas för att rikta medan avbildning.

6. Representativa resultat

Siffrorna och filmer skildrar exempel sensoriska neuroner och neurala celler crest märkta med membran riktad fluoroforer eller aktin biosensor sonden.

Figur 1 Confocal bilder (z-prognoser) av en Tg (ngn1: GFP-CAAX). Transgena embryo injiceras med 25 pg ngn1: mCherry-CAAX DNA. Den mCherry-CAAX etiketter en neuron röd (A) i en bakgrund med alla Rohon-Beard märkt sensoriska neuroner grön (B). C) Sammanslagen bild av både grön och röd kanaler. Skala bar = 50 ìm.

Figur 2 Confocal z-projektioner av nervceller i embryon injiceras med ~ 20 pg ngn1:.. MCherry-UtrCH DNA-A) Rohon-Beard sensoriska neuron i 16,5 HPF embryo. F-aktin signalen är stark i tillväxt kottar (pilspetsar) och utskjutande delar längs nybildade axon. B) neuron i 20 HPF embryo visar en stark F-aktin signal i tillväxt koner av grenade perifera axon (pilspetsar) och svagare signal i mer mogna centrala axoner (pilar). Skala bar = 50 ìm.

Discussion

Den optimala koncentrationen av tillförd arvsmassa varierar beroende på storlek och styrka initiativtagaren konstruera och bör bestämmas empiriskt. Injektion av för mycket DNA kan leda till ohälsosamma embryon med omfattande celldöd, medan för lite kommer att resultera i en mycket liten del av injicerade embryon uttrycka transgenen. DNA-uttrycket nivån korrelerar med styrka fluoroforen signalen, som varierar från cell till cell. Även om sorteringen embryon i epifluorescence utesluta de med extremt höga nivåer av uttryck. Märkta celler som ser mycket ljust brukar också visa tydliga tecken på toxicitet, såsom onormal cellmorfologin, mislocalization av taggade molekyler, och celldöd. En typisk DNA-injektion ger 5-10% av embryon som är lämpliga för avbildning.

F-aktin Biosensor kan fungera i en dominerande negativ mode uttryckt på höga nivåer. Om promotor-driven uttryck är problematisk, kan biosensor uttryckas ubiquitously genom att injicera mRNA. Fördelen med mRNA injektion är att uttrycket nivåer kan kontrolleras genom justering av koncentrationen av mRNA. Enskilda celler i dessa embryon är märkta av samtidig injektion av en DNA-konstruktion som innehåller en cell-specifikt uttryck promotor framförande av ett membran-lokaliserad fluoroforen. Vi har använt denna metod för att bilden F-aktin i neurallist celler ^7.

Vi utför ofta de encelliga märkning tekniken i transgena uttrycket linjer. Till exempel injicera en-3.1ngn1: mcherry plasmid in embryon av Tg (-3.1ngn1: GFP) linjen etikett enskilda sensoriska neuroner rött i en bakgrund av grön nervceller. Denna strategi möjliggör undersökning av beteendet hos en enskild cell inom ramen för hela cellen befolkningen.

Vi fokuserar här på bildbehandling neurala och neural crest beteenden cell och aktin distribution. Dock kan den allmänna metoden av vävnad specifika mosaik cell-märkning av DNA-plasmid injektion byggas ut för användning med fluorescerande fusionsproteiner liksom andra genetiskt kodade Biosensor sonder. Kombinera dessa tekniker kan låta utredarna att visualisera subcellulära lokalisering av specifika molekyler samt signalering mekanismer in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	A5040-250G
Sylgard Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184
QIAfilter Plasmid Midi Kit	Qiagen	12243
Low melting point agarose	Invitrogen	15517-014
Picospritzer	Parker Hannifin Corporation	051-0302-900