Summary
نقدم مبادئ قياس الأوكسجين التي تروي تفسفر والتصميم استعراض البورفيرين المستندة nanosensors شجيري للتصوير الأوكسجين في النظم البيولوجية.
Abstract
قياس الأوكسجين التي تروي تفسفر [1 ، 2] يتكون من الخطوات التالية : 1) يتم تسليم التحقيق في تهم المتوسطة (مثل الدم أو السائل الخلالي) ؛ 2) هو الكائن مضاءة بنور الطول الموجي المناسب من أجل إثارة التحقيق في حالة الثلاثي والخمسين ؛ 3) يتم جمع تفسفر المنبعثة ، ويتم تحليل مسارها الوقت لتعطي عمر تفسفر ، والتي يتم تحويلها إلى تركيز الأوكسجين (أو الضغط الجزئي ، ص.
Protocol
1. الوصف العام للبروتوكول قياس الأوكسجين
(هذا القسم لا يملك أي عمل ، ولكن أمر بالغ الأهمية لفهم ما تبقى من ورقة ، ويمكن تصويره ، على سبيل المثال ، وتسلسل من شرائح باور بوينت قليلة ، يرافقه صوت).
1.1) يتم تسليم التحقيق في المتوسط من الاهتمام ، على سبيل المثال ، في حقن الدم أو السائل الخلالي حيوان.
غير مضاءة 1.2) والكائن (سطح الأنسجة) مع ضوء الموجة المناسبة من أجل تعزيز التحقيق في حالته الثلاثي متحمس. عادة ما تحدث الإثارة عن طريق آلية واحدة فوتون. ومع ذلك ، في حالة تحقيقات استمرت الفوتون محسنة خاصة ، يمكن أن يتم الإثارة من خلال آلية ثنائية الفوتون ، الذي يسمح باستخدام المجهر تحقيقات في التطبيقات عالية الدقة. فوتون واحد ، يتيح الإثارة عموما أقل القرار المكانية ، ولكنه يتطلب أبسط الأجهزة ويمكن استخدامها في نقطة واحدة مع القياسات phosphorometers الألياف الضوئية LED مقرا لها.
1.3) التفسفر المنبعثة من التحقيق تنبع من الدولة الثلاثي طويلة الأمد. يجب أن تكون جزيء التحقيق مصممة خصيصا لتعطي غلة عالية من الكم الدولة الثلاثي وتنبعث تفسفر بدلا من مضان. بينما في حالة الثلاثي ، يمكن للمسبار تجربة الاصطدامية قاءات مع جزيئات الأكسجين ، والتي يمكن تفعيل اجتثاث الدولة الثلاثي -- "تبريد" عملية تسمى في غياب الأكسجين ، وعمر الدولة الثلاثي ، وبالتالي من تسوس تفسفر ، هو τ 0. في وجود الأكسجين ، وتقصير عمر تفسفر (τ) نتيجة للتبريد. هناك علاقة مباشرة بين عمر الدولة الثلاثي وكمية الأوكسجين الموجودة في البيئة. هذا هو المعروف ، شتيرن فولمر العلاقة التي تربط بين عمر (τ) من تفسفر لتركيز الأوكسجين [O 2] (أو ضغط الأكسجين الجزئي ص 2) :
في النظم البيولوجية ، والأكسجين هي حتى الآن الأكثر فعالية لفاكهه تقضي تفسفر ، مما يجعل أسلوب التبريد تفسفر انتقائية جدا للأوكسجين.
1.4) من أجل قياس مدى الحياة طن ، يتم اهمال الفوتونات المنبعثة الفسفورية في الوقت المناسب. على سبيل المثال ، وبعد نبض الإثارة ، يمكن جمعها في 200 ميكرو الفوتونات أول 15 ، 150 الفوتونات التي تم جمعها في ميكروثانية ال 15 المقبلة ، وهلم جرا ، حتى يتم جمع أي الفوتونات. رسم الأرقام في صناديق ضد الزمن يعطي تفسفر تسوس ، والتي يتم تحليلها لانتاج عمر τ. في التصوير ، ويتم تطبيق هذا الإجراء في كل بكسل من الصورة ، مما أدى إلى خرائط عمر تفسفر. قياسات أعمار لا تعير اهتماما لتحقيق التغاير التوزيع في جميع أنحاء الجسم ، وهو أمر شائع للعينات البيولوجية. وهكذا ، أعمار التقرير فقط على الأوكسجين. يتم تحويل أعمار τ في تركيزات الأكسجين باستخدام العلاقة شتيرن - فولمر.
2. بناء تحقيقات الفسفورية
تحقيقات الفسفورية لقياس الأوكسجين في النظم البيولوجية تتكون من chromophores الفسفورية (النوى) ، مغلفة في أقفاص مصنوعة من dendrimers -- البوليمرات hyperbranched العادية جدا [3]. Dendrimers حماية النوى من التفاعل مع البيئة والسيطرة على معدل انتشار الأكسجين إلى النوى ، مما يجعل من الممكن لتحسين حساسية ودينامية مجموعة من المجسات (ك ف المستمر في العلاقة شتيرن - فولمر). يتم تعديل مصطلحات من dendrimers مع خامل كيميائيا ماء البولي ايثيلين جلايكول (PEG) مجموعات ، مما يجعل تحقيقات عالية للذوبان في الماء ومنع تفاعلها مع الجزيئات البيولوجية.
النوى الفسفورية من تحقيقات وحزب العمال أو البالاديوم المجمعات البروفيرين والبورفيرنيات π الموسعة. π الموسعة البورفيرنيات هي البورفيرنيات التي تنصهر في حلقات بيرول مع شظايا العطرية الخارجية. π - ملحق يسمح ضبط خصائص تحقيقات الطيفية لتلبية متطلبات تطبيق التصوير معينة (مثل التصوير المقطعي مقابل المجهري). كمثال على ذلك ، وصفنا توليف tetaaryltetrabenzoporphyrins PD (PdAr TBP 4) [4]. 4 PdAr TBP لديهم فرق قوية في امتصاص جزء بعيدة الحمراء من الطيف تفسفر وقوية ، مناسبة تماما لقياس الأوكسجين البيولوجي.
تجميع لPdAr TBP 4 يتكون من الخطوات التالية :
2.1) إعداد tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) عن طريق التكثيف ليندسي [5] من tetrahydroisoindole مع benzaldehydes استبداله. إلى حل M 0.01 من tetrahydroisoindole (1 مكافئ) في CH <وأضاف دون> 2 CL (2) وألدهيد العطرية (1 مكافئ) تحت الأرجون. كان يحرك خليط التفاعل لمدة 10 دقيقة في الظلام في BF RT 3 O 2 xEt (0.2 مكافئ) وأضيف ، وكان يحرك خليط التفاعل في غ لح 2 إضافية وأضاف DDQ (1 مكافئ) ، وترك المزيج مع التحريك المستمر بين عشية وضحاها. وجرفت الحل مع 10 ٪ عبد القدير نا 2 SO 3 ، 10 ٪ عبد القدير نا 2 CO 3 ، 5 ٪ حمض الهيدروكلوريك القاعدة وأخيرا مع محلول ملحي. وقد جفت المرحلة العضوية على نا 2 SO 4 ، ثم ركز في الفراغ. وكان recrystallized بقايا من الكلورين CH 2 2 -- ثالثي بوتيل الاثير خليط لإعطاء وصول 4 TCHP على شكل مسحوق أخضر. غلة حوالي 50 ٪.
2.2) الإدراج من المشتريات للحصول على PdAr 4 TCHPs. وعولج الحرة قاعدة البورفيرنيات (1 مكافئ) مع 2 أو PdCl PD (OAC) 2 (1.2 مكافئ) في refluxing CH 3 CN في وجود فائض من إت 3 N (20 مكافئ). تم رصد التحويل بواسطة التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية تجاه (CH 2 الكلورين مذيب 2 - AcOH) وتعتبر كاملة بعد الفرقة سوريه من الاملاء على 468-472 نانومتر اختفى. وقد سمح هذا الخليط ليبرد ، مع المخفف CH 2 2 الكلورين وتصفيتها من خلال طبقة رقيقة من Celite لإزالة PD (0). وقد تبخرت المذيب ، وتنقيته بواسطة بقايا اللوني على العمود هلام السيليكا باستخدام الكلورين CH 2 2 كمذيب. وقد تم جمع جزء حمراء داكنة ، تبخر المذيب لإعطاء الهدف PdAr 4 TCHPs في الغلة الكمية تقريبا.
وأعدت 2.3) 4 PdAr TBP من خلال أكسدة TCHPs 4 PdAr مع الفائض 2 - حظيرة DDQ (16 مكافئ) في THF رجع. خلال refluxing ، غيرت لون من الاحمر الى الاخضر الداكن عميق. وكان تبخر المذيبات ، تضعف مع بقايا الكلورين 2 CH 2 ، وغسلها مع نا عبد القدير 10 ٪ 2 SO 3 ، والماء ومحلول ملحي. وقد جفت المرحلة العضوية على نا 2 SO 4 وتتركز في فراغ. وتنقيته بواسطة بقايا اللوني على هلام السيليكا (CH 2 شاطف الكلورين 2). وجمعت أول الخضراء الداكنة الكسر ، وتتركز في فراغ لإعطاء 85-90 ٪ من مسحوق PdAr4TBP كما الأخضر والأزرق.
2.4) استر الجماعات الهامشية من المشتريات tetrakis - (3،5 - dibutoxycarbonylphenyl) - tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) وتحلل باستخدام 10 أضعاف الفائض من كوه في 1 ٪ (V / V) الماء / THF في غ. وكان يصب المذيب من أملاح تترسب على البوتاسيوم تتكون من مشتقات حمض الكربوكسيلية من PdAr4TBP ل. أثارت حلت المواد الصلبة في الماء ، لح 2 إضافية ، مع اضرب المحمض. حمض الهيدروكلوريك على درجة الحموضة ~ 4-5. تم عزل يعجل التي حصلت عليها الطرد المركزي ، وغسلها بالماء وتجفف في فراغ.
حماية dendrons. يسمى كل فرع الفردية للdendrimer تغصن. هي التي شيدت dendrons حماية من أريل ، جليكاين اللبنات (AG). ويمكن تجميعها بسهولة dendrons AG رخيصة من المواد الأولية والمعزولة في نقاء عالية الغلة والتي اللوني خالية من الأساليب. توليف الجيل 2 (G2) AG - تغصن يتكون من الخطوات التالية :
2.4) تجميع لبنات البناء ، بوك محمية 3،5 - dicarboxyphenyl glycineamide وglycineamide 3،5 - dibutoxycarbonylphenyl ، وذلك باستخدام طريقة فيشر haloacyl هاليد.
2.5) توصيلات من لبنات البناء باستخدام CDMT / NMM الببتيد اقتران الكيمياء.
2.6) Deprotecting مجموعة الاتصال الأمينية اثارة حل تغصن G2 في TFA لمدة 2 ساعة على RT
2.7) للحصول على تجميع أعلى dendrons جيل ، تتكرر اقتران / deprotection الخطوات.
ويتحقق Dendrimer التجمع اقتران dendrons deprotected لPdAr4TBP (أو غيرها من البورفيرين) باستخدام الكيمياء اقتران HBTU / DIPEA.
2.8) أولا ، تتم إزالة المجموعات بوك واقية من تغصن. على سبيل المثال ، تم حل بوك محمية G3 تغصن (0.58 غ) في TFA (15 مل) ، وترك الخليط للرد على RT ل2H. تمت إزالة الأحماض عن طريق التبخر الدوارة ، والرضوخ للتغصن مثل الملح TFA. حلت البقايا في NMP الجافة (10 مل) ، وأضيفت بضع قطرات من DIPEA ، لإرواء آثار TFA.
2.9) قبل البدء في رد فعل اقتران ، فمن الأهمية بمكان أن تذوب تماما البورفيرين. على سبيل المثال ، تم حل حزب العمال tetracarboxyphenylporphyrin (0.061 غرام) في NMP الجافة (65 مل) تحت التدفئة بنحو 140 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ، في ظل تدفق النيتروجين.
2.10) وقد تم تبريد والحل وصولا الى درجة حرارة الغرفة ، واضاف HBTU (0،211 ز) ، وكان يحرك الخليط لمدة 5 دقائق.
وأضيف 2.11) DIPEA (0.35 مل) إلى الخليط في جزء واحد ، تليها مباشرة إضافة solutiعلى من الملح TFA من تغصن في NMP (انظر 2.8) ، وخليط من اليسار وبين عشية وضحاها تحت التحريك.
2.12) كان يصب الخليط في AQ 3 ٪. وقد تم جمع كلوريد الصوديوم (350 مل) ، ويعجل الناجم عن الطرد المركزي ، وغسلها بالماء ، MeOH وإت O 2 تعليق المتكررة من قبل / الطرد المركزي لانتاج الهدف البورفيرين - dendrimer.
وكان 2.13) ليتحلل استر الجماعات الهامشية ، وتعامل لأول مرة مع dendrimer NME 4 OH (~ 5 ملم) في DMSO / MeOH خلال فترة 20-60 دقيقة ، تليها إزالة المذيب كاملة. يسمح لنا هذا الإجراء لتوليد dendrimers مع عدد كاف من الجماعات الكاربوكسيلات إعطاء الذوبان المائي. لإكمال التحلل ، وكان يعامل dendrimer مع هيدروكسيد الصوديوم المائية 0.1N (بين عشية وضحاها). ونتيجة لذلك ، يمكن أن تكون معزولة نقية dendrimer البورفيرين ، الأحماض الكربوكسيلية في غلات 80-95 ٪.
تعديل هامش dendrimer. عند هذه النقطة ، بدءا من dendrimer البورفيرين - نفسه ، إما يمكن توليفها واحد أو اثنين تحقيقات الفوتون. في الحالة الأولى ، يتم تعديل كافة المجموعات الهامشية الكربوكسيل مع وحدات الربط -- منهجية المعروفة باسم PEGylation. في الحالة الأخيرة ، تقترن الأول الجماعات الكربوكسيل عدة مع chromophores هوائي ثنائي الفوتون (الكومارين - 343) مع تعديل الإيثيلنديامين (EDA) linkers ، تليها PEGylation من carboxyls المتبقية [6]. وDendrimers PEGylated باستخدام monomethoxyoligoethyleneglycolamine (M - PEG - NH 2 ، شارع. ميجاوات 1000) باستخدام HBTU / DIPEA الكيمياء اقتران.
وأضيف 2.14) لإيجاد حل للتغصن في NMP (أو DMF) (1-10 مم) 1.25 أضعاف الفائض من HBTU ، وكان يحرك خليط التفاعل على RT لمدة 10 دقيقة. وأضيف فائض 6.25 أضعاف من DIPEA ، تليها إضافة الفوري للفائض 1.25 أضعاف من طراز M - PEG - NH2. كان يحرك خليط التفاعل لمدة 2 يوما في غ. وقد تم ادراج إثيل الأثير إلى خليط التفاعل ، وفصل يعجل شكلت بواسطة الطرد المركزي وإعادة عجل ، من قبل THF إضافة اثيل الأثير.
وقد تحقق 2.15) تنقية النهائي مع حجم والاستبعاد اللوني من جمع للمرحلة المواجهة الأولى. تم حل PEGylated البورفيرين - dendrimer في كمية صغيرة من THF (~ 15 مل) ، وتحميلها على الجزء العلوي من العمود الكروماتوغرافي مليئة البوليسترين SEC المرحلة (Biorad ، Biobeads S - X1). وكان eluted العمود مع THF النقي ، وجمعت الفرقة داكنة اللون تتحرك مع الجبهة.
تم إزالة 2.16) THF على المبخر الدوار ، والمجففة المواد المتبقية في فراغ.
3. المسبار توصيف
توصيف Photophysical يتضمن قياسات أطياف الامتصاص والانبعاث التحقيق ، وعمر تفسفر τ 0 وشتيرن ، فولمر الأكسجين تبريد الثوابت ك ف في ظل الظروف الفسيولوجية.
ويتم الحصول على 3.1) وأطياف الامتصاص والانبعاث في ظل الظروف المحيطة باستخدام الأدوات القياسية (معمل ومقياس التألق المستمر). وتستخدم حلول ~ ميكرومتر 1 من التحقيق.
3.2) المقبل ، ويتم الحصول على قطعة المعايرة شتيرن - فولمر. وهذا هو القياس الأكثر أهمية ، لأنها تتيح لنا ربط عمر التحقيق الى تركيز الأوكسجين.
3.3) يتم وضع حل لجنة التحقيق في برنامج تلفزيوني عازلة (7.2 درجة الحموضة) في كفيت اسطواني الخاصة ، والتي يتم وضع درجة الحرارة داخل غرفة التحكم ، وتقع داخل القفص غير منفذة للضوء مع منافذ للألياف البصرية الإثارة وانبعاث. يتم إحضارها إلى الألياف اتصال وثيق مع كفيت داخل غرفة في الزاوية اليمنى الهندسة.
3.4) يتم إغلاق كفيت مع سدادة ، حيث يتم إدخال إلكترود الأكسجين شديدة الحساسية من نوع كلارك (CK - الأكسجين الكهربائي). السدادة يحتوي أيضا على المنافذ إبرة اثنان لمدخل ومخرج من الأرجون. غير منغمسين في القطب الحل ، في حين أن مجرد توفير الإبر لتدفق تدفق الغاز فوق سطح المحلول. في البداية ، لم يتم توصيل الأرجون للمدخل.
3.5) يتم تعيين درجة الحرارة إلى القيمة المطلوبة (عادة 36-37 درجة مئوية) ، وترك الحل للموازنة مع التحريك.
توصيل 3.6) والألياف الإثارة إلى ميناء الإثارة من phosphorometer الرقمية ، والتي يشغلها جهاز كمبيوتر. مصدر الضوء في phosphorometer هو الصمام عالية الطاقة ، التي تسيطر عليها الإخراج هو مد 333 كيلو هرتز / مجلس A. توصيل الألياف الانبعاثات الضوئية إلى منفذ آخر للphosphorometer ، الذي يقترن إلى APD عالية الأشعة تحت الحمراء حساسة (سيل الضوئي). يتم تضخيمه الناتج من الصمام الثنائي وتغذي قناة / A D من لوحة التحكم نفسه ، والذي يسمح التزامن بين الإثارة وقنوات الانبعاثات.
3.7) وبرنامج حاسوبي لمراقبة بنمستويات توليد نبضات الإثارة في أي الطول المطلوب (مثلا 5 أو 10 مللي ثانية) ، تليها مجموعة من تسوس تفسفر خلال أي فترة التعسفي المختار (عادة 2-3 مللي ثانية). الوقت اللازم لقياس مدى الحياة واحد هو عادة 0،5-1 ثانية ، ومع ذلك ، يمكن الحصول على قياسات بأسرع 10-20 في الثانية الواحدة.
3.8) يتم تضخيمه إخراج القطب الأكسجين وإخراج لوحة إلى أخرى د / على نفس الكمبيوتر. هذا هو مجلس التردد المنخفض (1 كيلو هرتز كحد أقصى) ، والذي يستخدم لتسجيل الكهربائي الحالي في فترات زمنية محددة. برنامج لتسجيل البيانات في وقت واحد كهربائي يعمل مع برنامج phosphorometer.
3.9) وبمجرد أن الحل هو في درجة الحرارة المتوازنة ، يتم تهيئة كل phosphorometer والبرامج الكهربائي في نفس الوقت لتنفيذ كل القياسات 10 ثانية. يتم تسجيل مخرجاتها بشكل متزامن في ملفين منفصلين. بعد ذلك ، يتم توصيل الأرجون الى ميناء على مدخل السدادة كفيت.
3.10) والأرجون تتدفق على سطح أثار حل ، فإنه يستبدل تدريجيا الأوكسجين. هذا يؤدي إلى انخفاض في التيار الكهربائي وزيادة في عمر تفسفر ، والتي تقاس بها phosphorometer. عادة ، يتم تشريد الأوكسجين شكل الحل تماما بعد حوالي 2 ساعة ، وخلال الوقت الذي يتم تسجيل البيانات بالكامل تلقائيا إلى الملفات.
3.11) وبعد نهاية تشغيل المعايرة ، يتم استيراد البيانات القطب وعمر تفسفر في برنامج التحليل القياسي (المنشأ Miocrocal مثلا). التيار الكهربائي يعتمد على تركيز الأوكسجين خطيا ، والقطب استخدامه الصفر تقريبا في الأكسجين صفر. عند الضغط الجوي ، ومن المعروف ب 2 (حوالي ملم زئبق 150). وبالتالي ، يمكن تحويل البيانات الكهربائي مباشرة إلى مقياس الأكسجين ، ويمكن بناؤها على قطعة من عمر تفسفر معكوس مقابل ص 2. تم تجهيز هذه المؤامرة مع خط مستقيم باستخدام طريقة المربعات الصغرى لإعطاء الأكسجين KQ تبريد مستمر كما في المنحدر. يتم الحصول على عمر تفسفر T0 إما من يصلح نفسه (كما عكس التقاطع) أو مباشرة من قياس الأكسجين في صفرية.
اجتمع في لمحاكاة الظروف في النظام التجريبي الحقيقي (دم حيوان -- 3.12) إذا لزم الأمر ، يتم تكرار المعايرة باستخدام حل لجنة التحقيق في وجود الزلال -- البروتين موجود في بلازما الدم في تركيزات عالية ، في الجسم الحي). ينبغي للحصول على شتيرن - فولمر المؤامرات تكون متطابقة إذا dendrimer هو حماية يدقق جيدا والجماعات PEG عزل المسبار من الاتصالات مع الزلال. خلاف ذلك ، سيقوم المسبار والبروتينات في الدم تتفاعل ، والتي من شأنها أن تؤدي إلى مؤامرة شتيرن - فولمر تغيير ، مما تسبب الغموض في القياسات الأوكسجين.
وتستخدم ثوابت المعايرة وبالتالي الحصول على تجارب في التصوير حيث تركيز الأوكسجين هي معروفة مسبقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
مع التقدير والإمتنان الدعم من المنح وEB007279 HL081273 من المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-methylpyrrolidinone | NMP | ||
| trifluoroacetic acid | TFA | ||
| diisopropylethylamine | DIPEA | ||
| 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate | HBTU | ||
| dimethylsulfoxide | DMSO | ||
| CDMT=1-chloro-3,5-dimethoxytriazine | CDMT | ||
| NMM=N-methylmorfoline | NMM |
References
- Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
- Lebedev, A. Y. Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems. Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).
- Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins. Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).
- Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions. Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).
- Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen. J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).
