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Biology

生体系における酸素イメージング用燐光ナノプローブの合成とキャリブレーション

Published: March 3, 2010 doi: 10.3791/1731

Summary

我々は、リン光消光と生体系における酸素のイメージングのためのポルフィリン系樹状ナノセンサーの見直しの設計によって酸素測定の原理を提示する。

Abstract

リン光消光による酸素の測定[1、2]次の手順で構成されています:1)プローブは、関心のある媒体(例えば血液または間質液)に配信されます、2)オブジェクトは、励起するために適切な波長の光で照らされているその三重項状態へのプローブ、3)放射される燐光が収集され、その時間のコースは酸素濃度(または分圧に変換される燐光寿命を、得るために分析され、PO

Protocol

1。酸素の測定プロトコルの一般的な説明

(このセクションでは、任意のアクションを持っていますが、紙の残りを理解する上で重要ですしていません。これは、音声を伴う、いくつかのパワーポイントのスライドの順序として、例えば、撮影することができます。)

プローブが関心の媒体に配信される1.1)、例えば、動物の血液または間質液に注入。

1.2)オブジェクト(組織の表面が)、その励起三重項状態へのプローブを促進するために適切な波長の光で照らされている。一般的に励起は、一光子のメカニズムを介して行われます。しかし、特別な二光子強化されたプローブの場合には、励起は、高分解能顕微鏡のアプリケーションでプローブを使用して許可する二光子機構を介して行うことができます。一光子励起は、一般的に以下の空間分解能を提供しますが、シンプルな計測機器を必要とし、LEDベースの光ファイバphosphorometers付きシングルポイント測定で使用することができます。

1.3)プローブから放射される燐光は、長寿命の三重項状態に由来する。プローブ分子は、特別に三重項状態の高い量子収率を得たとの代わりに蛍光の燐光を発するように設計する必要があります。三重項状態にある間、プローブは、三重項状態を非アクティブにできる、酸素の分子と衝突の出会いを体験することができます - "。焼き入れ"と呼ばれるプロセスを酸素のない状態で、三重項状態の、そしてそれ故に燐光減衰の寿命は、τ0です。酸素の存在下では、燐光寿命(τ)消光の結果として短縮されます。三重項状態の寿命と環境中の酸素量との間の直接的な関係があります。これは、酸素濃度[O 2](または酸素分圧PO 2)に燐光の寿命(τ)を接続するよく知られたスターン-ボルマーの関係、次のとおりです。

式

生物学的システムでは、酸素ははるかに酸素に対して非常に選択的なリン光急冷法を作る燐光、最も効果的な消光剤です。

1.4)生涯tを測定するために、放出された燐光光子は時間的に選別します。は光子が収集されなくなるまで例えば、励起パルスの後、200光子は、というように、最初の15マイクロ秒単位で次の15マイクロ秒単位で収集した150光子を集め、そしてされる場合があります。ビン内の数字は、寿命τを得るために分析される燐光ディケイを、与える時間に対してプロット。イメージングでは、この手順は、リン光寿命のマップで、その結果、画像の各ピクセルに適用されます。寿命の測定は、生体試料に共通のオブジェクト、全体でプローブの分布の不均質に小文字の区別はありません。従って、寿命は酸素のみで報告する。寿命τはスターン - ボルマーの関係を用いて酸素濃度に変換されます。

2。燐光プローブの構築

デンドリマーの構築ケージにカプセル化された生体系における酸素測定用の燐光プローブ燐光発色団から構成される(コア)、 - 非常に規則的なハイパーブランチポリマー[3]。デンドリマーは、環境との相互作用からコアを保護し、それが可能なプローブの感度とダイナミックレンジ(スターン-ボルマー関係の定数k q)を最適化すること、コアへの酸素の拡散速度を制御します。デンドリマーの末端は、プローブが高く、水溶性と生体高分子との相互作用を防止すること、化学的に不活性な親水性のポリエチレングリコール(PEG)基で修飾されています。

プローブのリン光コアは、ポルフィリンとπ拡張ポルフィリンのPtまたはPd複合体である。 π-拡張ポルフィリンのピロール環が外部の芳香族の断片と融合されているポルフィリンです。 π- Extensionはプローブ分光特性のチューニングは、特定のイメージングアプリケーション(例:顕微鏡対断層撮影法)の要件を満たすことができます。例として、我々は、Pdのtetaaryltetrabenzoporphyrinsの合成(PdAr 4 TBP)[4]について説明します。 PdAr 4 TBPのは、スペクトルと強い燐光の遠赤の部分で強力な吸収帯を持って、よく生物学的酸素測定に最適です。

PdAr 4 TBPの合成は、次の手順で構成されます。

2.1)置換ベンズアルデヒドとリンジー縮合によるtetraaryltetracyclohexenoporphyrinsの調製(Ar4TCHP)tetrahydroisoindoleの[5]。 CHのtetrahydroisoindole(1当量)の0.01 M溶液へ<サブ> 2 CL 2芳香族アルデヒド(1当量)をアルゴン下で添加した。反応混合物を室温BF、暗所で10分間攪拌した3 xEt 2 O(0.2当量)を添加し、そして反応混合物をさらに2時間室温で撹拌したDDQ(1当量)を加え、そして混合物を連続的に攪拌しながら一晩放置した。溶液を10%水溶液のNa 2 SO 3、10%水溶液のNa 2 CO 3、5%HCl水溶液で、最後に飽和食塩水で洗浄した。次いで、有機相を真空で濃縮し、Na 2 SO 4上で乾燥させた。アルゴンの緑色の粉末として、4 TCHPを与えるためにtert -ブチルエーテルの混合物-残留物をCH 2 Cl 2から再結晶した。収量は約50%です。

2.2)PdAr 4 TCHPsを得るためにPdの挿入。フリーベースポルフィリンは、(1当量)のEt 3 N(20当量)の過剰の存在下でCH 3 CNを還流でPdCl 2またはPd(OAC)2(1.2当量)で処理した。変換は、紫外-可視分光法によって監視(溶媒をCH 2 Cl 2 - AcOHを)と姿を消した468から472 nmのディクテーションのSoret帯の後に完了したと見なされました。混合物をCH 2 Cl 2で希釈し、パラジウム(0)を削除するセライトの薄層を通して濾過し、冷却した。溶媒を留去し、残渣を溶媒として塩素2 CH 2を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。暗赤色画分を採取し、溶媒をほぼ定量的収率でターゲットPdAr 4 TCHPsを蒸発させて。

2.3)PdAr 4 TBPのは還流THF中DDQの2倍過剰(16当量)でPdAr 4 TCHPsの酸化によって調製した。還流中に、色は暗赤色から深緑に変更。溶媒を蒸発させ、残渣を10%水溶液のNa 2 SO 3、水および食塩水で洗浄し、CH 2 Cl 2で希釈した。有機相をNa 2 SO 4上で乾燥し、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(溶離液CH 2 Cl 2中 )により精製した。第一暗緑色画分を回収し、青緑色粉末としてPdAr4TBPのの85-90%を与えるために真空中で濃縮した。

2.4)Pdの周辺エステル基テトラキス - (3,5 - dibutoxycarbonylphenylは) - テトラベンゾポルフィリンは(PdAr4TBP)を室温で1%のKOHの10倍過剰(v / v)の水/ THFを用いて加水分解した。溶媒をPdAr4TBPののカルボン酸誘導体の形成カリウム塩の沈殿物からデカントした。固形物を濃塩酸で酸性化し、さらに2時間撹拌し、水に溶解した。 pHが4〜5に塩酸。得られた沈殿は、遠心分離によって単離し、水で洗浄し、真空中で乾燥させた。

デンドロンを保護すること。デンドリマーの個々の枝は、 デンドロンと呼ばれています。保護デンドロンは、アリール-グリシン(AG)のビルディングブロックから構築されています。 AGのデンドロンは、簡単に安価な出発物質から合成し、クロマトグラフィー、無料の方法で高純度かつ高収率で単離することができる。第2世代(G2)AG -デンドロンの合成は、次の手順で構成されます。

2.4)フィッシャーハロアシルハライド法で使用してビルディングブロックの合成、Boc -保護3,5 - ジカルボキシglycineamideと3,5 - dibutoxycarbonylphenyl glycineamide、。

2.5)CDMT / NMMペプチドカップリング反応を用いたビルディングブロックのカップリング。

2.6)室温で2時間TFAでG2デンドロンのソリューションを撹拌することによって焦点アミノ基の脱保護

より高い世代のデンドロンのアセンブリーの場合2.7)、カップリング/脱保護の手順が繰り返されます。

デンドリマーアセンブリは、HBTU / DIPEA結合化学を使用してPdAr4TBPに脱保護されたデンドロン(または他のポルフィリン)のカップリングによって達成される。

まず2.8)、のB​​oc -保護基は、デンドロンから削除されます。例えば、Boc -保護のG3デンドロンは、(0.58g)をTFA(15ml)に溶解し、そして混合物を2時間室温で反応させた。酸をTFA塩としてデンドロンをもたらし、回転蒸発によって除去した。残渣を乾燥NMP(10ml)に溶解し、DIPEAの数滴は、TFAの痕跡をクエンチするために、追加されました。

2.9)カップリング反応を開始する前に、それは完全にポルフィリンを溶解することが重要です。例えば、白金tetracarboxyphenylporphyrin(0.061グラム)を140℃に加熱して乾燥NMP(65 ml)に溶解し、℃で10分間を、窒素気流下で。

溶液を室温に冷却した2.10)、HBTU(0.211グラム)を加え、そして混合物を5分間撹拌した。

2.11)DIPEA(0.35 ml)を直ちにsolutiを加えて、一度に混合物に添加したNMPでのデンドロンのTFA塩(2.8参照)の上に、そして混合物を撹拌下に一晩放置した。

2.12)混合物を3%水溶液に注いだ。塩化ナトリウム(350 ml)を、そして得られた沈殿物を遠心分離により回収し、繰り返しの中断/ターゲットポルフィリンデンドリマーを得るために、遠心分離により水、メタノール、及びEt 2 Oで洗浄した。

周辺エステル基を加水分解するために2.13)、デンドリマーは、最初の完全な溶媒除去に続いて20〜60分の期間にわたってDMSO / MeOH中でNME 4 OH(〜5mMの)、で処理した。この手順では、私たちは、水溶性を与えるためにカルボキシレート基の十分な数を持つデンドリマーを生成することができました。加水分解を完了するには、デンドリマーは、0.1N NaOH水溶液(一晩)で処理した。その結果、純粋なポルフィリンデンドリマーカルボン酸は80〜95パーセントの収率で単離することができた。

デンドリマーの周辺部の修正。この時点では、同一のポルフィリンデンドリマーから始めて、どちらか1つまたは2つの光子のプローブを合成することができる。最初のケースでは、すべての周辺機器のカルボキシル基は、PEGユニットを使用して変更されている- PEG化として知られている方法論を。後者の場合には、いくつかのカルボキシル基は、最初の2つの光子アンテナの発色団(クマリン- 343)残りのカルボキシルのPEG化に続いて、エチレンジアミン(EDA)リンカーで修飾された[6]。結合されているデンドリマーは、HBTU / DIPEA結合化学を使用してmonomethoxyoligoethyleneglycolamine(M - PEG - NH 2、のAV。MW 1000)を用いてPEG化した。

NMPでのデンドロン(またはDMF)(1-10 mM)をHBTUの1.25倍過剰の溶液に、2.14)を加え、そして反応混合物を10分間室温で撹拌した。 DIPEAの6.25倍過剰は、m - PEG - NH2の1.25倍過剰の即時添加し、続いて、追加されました。反応混合物を室温で2日間攪拌した。ジエチルエーテルを反応混合物に添加し、生成した沈殿物をジエチルエーテルの添加によりTHFから遠心分離や再沈殿により分離した。

2.15)最終精製は、まずフロントの段階の収集により、サイズ排除クロマトグラフィーによって達成された。 PEG化ポルフィリンデンドリマーは、THFの少量(〜15ml)に溶解し、ポリスチレンSEC相(バイオラッド、Biobeads S - X1)を充填したクロマトグラフィーカラムの上にロードされています。カラムは、純粋なTHFで溶出させた、とフロントに移動し、暗い色のバンドを回収した。

2.16)のTHFをロータリーエバポレーターで除去し、残りの材料は、真空中で乾燥させた。

3。プローブの特性評価

光物理的特性は、生理的条件下で、プローブの吸収と発光スペクトルの測定は、リン光寿命τ0とスターン-ボルマーの酸素消光定数k qを含みます。

3.1)吸収と発光スペクトルは、標準的な計装を(分光光度計と安定した蛍光光度計)を使用して周囲条件下で得られる。プローブの〜1μMのソリューションが使用されます。

3.2)次に、スターン - ボルマーのキャリブレーションプロットが得られる。それは、私たちは酸素濃度にプローブの寿命を関連付けることができるため、これは、最も重要な測定です。

3.3)PBS緩衝液(pH7.2)におけるプローブの溶液を励起し、放出光ファイバ用のポートと光不透過性ケージの内側にある温度制御されたチャンバ内に配置されている特殊な円筒形キュベット、、に配置されます。繊維が直角形状のチャンバー内のキュベットに密着されています。

3.4)キュベットは、高感度クラーク型酸素電極(CK -酸素電極)が挿入される、ストッパーで閉じられます。ストッパーはまた、入口とアルゴンのコンセントの2つのニードルポートが含まれています。針は、単にソリューションの表面上のガス流の流れのために提供するのに対し、電極は、溶液中に浸漬される。最初は、アルゴンを注入口に接続されていません。

3.5)温度を所望の値(通常は36〜37 ° C)に設定され、溶液を平衡化のために攪拌する。

3.6)励起光は、PCが運営するデジタルphosphorometerの励起ポートに接続されている。 phosphorometerの光源は、その出力は333 kHzのD / Aボードによって制御されているハイパワーLED、です。放射繊維は、非常に赤外線に敏感なAPD(アバランシェフォトダイオード)に結合さphosphorometer、別の光ポートに接続されています。ダイオードの出力を増幅し、励起および発光チャネル間の同期を可能にする同じコントロールボード、のA / Dチャネルに供給されます。

3.7)制御ソフトウェアアル任意の選択された期間(通​​常は2〜3ミリ秒)の間に燐光ディケイのコレクションに続いて任意の長さ(例えば5または10ミリ秒)の励起パルスの安値は世代、。単一の寿命測定に要する時間は、通常、0.5から1秒である、しかしながら、測定値は、毎秒10から20のように迅速にして得ることができる。

3.8)酸素電極の出力は、同じPC上で別のA / Dボードに増幅され、指示されている。これは、選択した期間における電流電極を記録するために使用される低周波ボード(1 kHzの最大値)、である。電極のデータを記録するためのプログラムはphosphorometerソフトウェアと同時に動作します。

3.9)溶液温度が平衡になると、phosphorometerと電極の両方のプログラムは、毎10秒の測定を実行すると同時に初期化されますそれらの出力は2つの別々のファイルに同期して記録されます。その後、アルゴンは、キュベットのストッパーでインレットポートに接続されています。

3.10)、アルゴンが撹拌された溶液の表面上を流れるように、それは徐々に酸素を置き換えます。電極電流の減少とphosphorometerによって測定される燐光寿命の増加でこの結果。通常、酸素が完全にデータが完全に自動的にファイルに記録している間、約2時間、後の溶液を形成変位される。

3.11)滴定の実行終了後、電極のデータと燐光寿命は、標準的な解析プログラム(例えばMiocrocal起源)にインポートされます。電極電流は酸素濃度に直線的に依存し、電極が使用されることはゼロ酸素で実質的にゼロです。大気圧下で、PO 2は (150ミリメートルHg約)知られています。従って、電極のデータを直接酸素スケールに変換することができ、PO 2対逆燐光寿命のプロットを構築することができる。このプロットは、その傾きとして酸素消光定数KQを与えるために最小二乗法を用いた直線が装備されています。燐光寿命t0は、同じフィット(切片の逆数として)から、または直接ゼロ酸素での測定から得られる。

高濃度で血漿中に存在するタンパク質、 - - 必要に応じて3.12)、滴定は、アルブミンの存在下でプローブの溶液を用いて繰り返される条件をエミュレートするために(実際の実験系において動物の血液を満たしてin vivoで )。デンドリマーはよくプローブを保護されており、PEG基がアルブミンとの接触からプローブを分離する場合取得スターン-ボルマープロットは同一である必要があります。そうでない場合は、プローブと血液中のタンパク質が相互作用し、それは酸素の測定にあいまいさを引き起こして、変更されたスターン - ボルマーのプロットにつながる。

こうして得られた校正定数は、酸素濃度が先験的に未知のイメージング実験に使用されています。

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Acknowledgments

NIH、米国からの補助金EB007279とHL081273のサポートは感謝しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-methylpyrrolidinone NMP
trifluoroacetic acid TFA
diisopropylethylamine DIPEA
2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate HBTU
dimethylsulfoxide DMSO
CDMT=1-chloro-3,5-dimethoxytriazine CDMT
NMM=N-methylmorfoline NMM

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References

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  4. Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins. Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).
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Tags

細胞生物学、問題37、酸素、リン、ポルフィリン、デンドリマー、イメージング、ナノセンサー、二光子
生体系における酸素イメージング用燐光ナノプローブの合成とキャリブレーション
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Sinks, L. E., Roussakis, E.,More

Sinks, L. E., Roussakis, E., Esipova, T. V., Vinogradov, S. A. Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems. J. Vis. Exp. (37), e1731, doi:10.3791/1731 (2010).

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