Summary
Vi presenterar principerna för syre mätningar av fosforescens härdning och granska utformningen av porfyrin-baserade dendritiska nanosensorer för syre avbildning i biologiska system.
Abstract
Syre mätning av fosforescens härdning [1, 2] består av följande steg: 1) givaren levereras i mediet av intresse (t.ex. blod eller interstitiell vätska), 2) föremålet belyses med ljus av lämplig våglängd för att uppväcka sonden i sin triplettillstånd, 3) som avges fosforescens samlas, och tidsförloppet analyseras för att ge den fosforescens livslängd, som omvandlas till syrekoncentrationen (eller partialtryck PO
Protocol
1. Allmän beskrivning av syre mätprotokoll
(Detta avsnitt har inte någon åtgärd, men är avgörande för att förstå resten av tidningen. Det kan filmas, t.ex. som en följd av några diabilder Power Point, tillsammans med rösten.)
1,1) Sonden levereras i mediet av intresse, till exempel injiceras i blodet eller interstitiell vätska av ett djur.
1,2) objektet (vävnadens yta) belyses med ljus av lämplig våglängd för att främja sonden i sin glada triplett tillstånd. Normalt excitation sker via en-foton mekanism. Men i fallet med speciella två-photon-förstärkt prober kan excitation göras via två-photon mekanism som tillåter användning av sonder i högupplöst mikroskopi applikationer. En photon excitation ger i allmänhet mindre rumslig upplösning, men kräver enklare instrumentering och kan användas i en enda punkt mätningar med LED-baserad fiberoptisk phosphorometers.
1,3) Fosforescens avges av sonden kommer från långlivade triplettillstånd. Sonden molekylen ska vara särskilt utformade för att ge höga kvantutbytet av triplettillstånd och släpper fosforescens istället för fluorescens. Även i triplett tillstånd, kan sonden uppleva kollisioner möten med molekyler av syre, vilket kan avaktivera triplettillstånd - ". Härdning" en process som kallas I avsaknad av syre, livslängden på triplett staten, och därmed även fosforescens förfall, är τ 0. I närvaro av syre, är den fosforescens livslängd (τ) förkortas till följd av härdning. Det finns ett direkt samband mellan livslängd triplettillstånd och mängden syre i miljön. Detta är den välkända Stern-Volmer relation, som förbinder livslängd (τ) i fosforescens att syrekoncentrationen [O 2] (eller syrets partialtryck PO 2):
I biologiska system, är syre i särklass mest effektiva quencher av fosforescens, vilket gör fosforescens härdning metoden mycket selektiv till syre.
1,4) För att mäta livslängd t, är det avgivna fosforescerande fotoner binned i tid. Till exempel, efter excitation puls, kanske 200 fotoner tas på det första 15 mikrosekunder, 150 fotoner samlats under de kommande 15 mikrosekunder, och så vidare, tills inga fotoner samlas in. Siffrorna i soptunnor plottad mot tiden ge fosforescens förfall, som analyseras för att ge livstid τ. I avbildning, är detta förfarande tillämpas i varje pixel i bilden, vilket resulterar i fosforescens livstid kartor. Mätningar av livstider är okänsliga för den heterogeniteter av givare distribution i hela objektet, som är gemensam för biologiska prover. Således livslängd endast rapportera på syre. Livstid τ omvandlas till syre koncentrationer med Stern-Volmer relation.
2. Konstruktion av fosforescerande sonder
Fosforescerande givare för syre mätningar i biologiska system består av fosforescerande kromoforer (kärnor) inkapslade i burar byggda av dendrimererna - mycket vanlig hyperbranched polymerer [3]. Dendrimererna skydda kärnor från interaktion med miljön och kontrollera graden av syre diffusion till kärnor, vilket gör det möjligt att optimera känslighet och dynamiskt omfång av sonder (konstant k q i Stern-Volmer relation). Linjens ändstationer dendrimererna är modifierade med kemiskt inert hydrofila polyetylenglykol (PEG) grupper, vilket gör sonder hög vattenlöslighet och förhindra deras samspel med biologiska makromolekyler.
Fosforescerande kärnor av sonder Pt eller Pd komplex av porfyriner och π-utökad porfyriner. π-Utökade porfyriner är porfyriner som Pyrrole ringar är smält med externa aromatiska fragment. π-anknytning möjliggör inställning av sonder spektroskopiska egenskaper för att uppfylla kraven i ett särskilt bildprogram (t.ex. mikroskopi vs tomografi). Som exempel beskriver vi syntesen av Pd tetaaryltetrabenzoporphyrins (PdAr 4 TBP) [4]. PdAr 4 TBP-talet har kraftfulla absorption band i fjärran röda delen av spektrumet och starka fosforescens, väl lämpat för biologisk syre mätningar.
Syntesen av PdAr 4 TBP är består av följande steg:
2,1) Beredning av tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) av Lindsey kondens [5] av tetrahydroisoindole med substituerade benzaldehydes. Till en 0,01 M lösning av tetrahydroisoindole (1 eq) i CH <sub> 2 cl 2 de aromatiska aldehyder (1 eq) har lagts till under argon. Reaktionsblandningen rördes i 10 minuter i mörker vid RT BF 3 XET 2 O (0,2 eq) lades till och reaktionsblandningen rördes vid RT ytterligare 2 h. DDQ (1 eq) lades, och blandningen var kvar över natten under ständig omrörning. Lösningen blev tvättas med 10% aq Na 2 SO 3, 10% aq Na 2 CO 3, 5% AQ HCl och slutligen med saltlake. Den organiska fasen torkas över Na 2 SO 4, därefter koncentreras i vakuum. Återstoden var omkristalliserad från CH 2 Cl 2 - tert-butyleter blandning för att ge Ar 4 TCHP som gröna pulver. Avkastningen är cirka 50%.
2,2) Införande av Pd att få PdAr 4 TCHPs. Gratis-base porfyriner (1 eq) behandlades med PdCl 2 eller Pd (Oac) 2 (1,2 EQ) i refluxing CH 3 CN i närvaro av överskott av Et 3 N (20 eq). Konverteringen övervakas av UV-VIS-spektroskopi (lösningsmedel CH 2 Cl 2-AcOH) och anses vara fullständig efter Soret band diktamen vid 468-472 nm försvann. Blandningen fick svalna, utspätt med CH 2 Cl 2 och filtreras genom ett tunt lager av Celite att ta bort Pd (0). Lösningsmedlet har avdunstat och återstoden renades genom kromatografi på kiselgelkolonn med CH 2 Cl 2 som lösningsmedel. Mörkröd fraktionen samlades in, var lösningsmedlet avdunstat att ge rikta PdAr 4 TCHPs i nästan kvantitativa avkastning.
2,3) PdAr 4 TBP-talet var förberedda genom oxidation av PdAr 4 TCHPs med 2-faldigt högre än DDQ (16 eq) i refluxed THF. Under refluxing bytte färg från mörkt rött till djupt grönt. Lösningsmedlet har avdunstat, var återstoden spädas med CH 2 Cl 2, tvättas med 10% aq Na 2 SO 3, vatten och saltlake. Den organiska fasen torkas över Na 2 SO 4 och koncentreras i vakuum. Återstoden renades genom kromatografi på kiselgel (eluenten CH 2 Cl 2). Den första mörkgröna fraktionen samlades in, koncentrerad vakuum för att 85-90% av PdAr4TBP är som blå-gröna pulver.
2,4) Perifera estergrupper av PD tetrakis (3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) var hydrolyseras med 10-faldigt högre än KOH i 1% (v / v) vatten / THF vid RT. Lösningsmedlet var dekanterat från fällningen av de bildade kaliumsalter av karboxylsyra derivat av PdAr4TBP talet. De fasta partiklarna var upplöst i vatten, rörs för ytterligare 2 tim, syrad med konc. HCl till pH ~ 4-5. De erhållna fällningen var isolerad genom centrifugering, tvättas med vatten och torkas i vakuum.
Skydda dendrons. Varje enskild gren av dendrimer kallas kvistar. Skydda dendrons är tillverkade av aryl-glycin (AG) byggstenar. AG dendrons lätt kan syntetiseras från billiga utgångsmaterial och isolerade i hög renhet och avkastning med hjälp av kromatografi-fria metoder. Syntes av generation 2 (G2) AG-kvistar består av följande steg:
2,4) Syntes av byggstenar, Boc-skyddade 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide och 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide, med hjälp av Fischer haloacyl halid metod.
2,5) Koppling av byggstenarna med CDMT / NMM peptid koppling kemi.
2,6) Deprotecting i fokus aminogrupp genom att röra en lösning på G2 kvistar i TFA under 2 h vid RT
2,7) För montage av de högre generationen dendrons har koppling / deprotection steg upprepas.
Dendrimer montering sker genom koppling av deprotected dendrons till PdAr4TBP (eller andra porfyriner) med hjälp av HBTU / DIPEA koppling kemi.
2,8) Först är de Boc-skyddande grupper bort från kvistar. Till exempel var Boc-skyddad G3 kvistar (0,58 g) upplöst i TFA (15 ml), och blandningen lämnades att reagera på RT för 2h. Syran togs bort av roterande avdunstning, som ger den kvistar som TFA-salt. Återstoden upplöstes i torr NMP (10 ml) och några droppar DIPEA har lagts till, för att släcka spåren av TFA.
2,9) Innan kopplingen reaktionen är det viktigt att helt upplösa porphyrin. Till exempel var Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0,061 g) löses upp i torra NMP (65 ml) under upphettning vid 140 ° C i 10 min, under kväve flöde.
2,10) Lösningen blev svalnat till rumstemperatur, var HBTU (0,211 g) tillsätts, och blandningen rördes i 5 min.
2,11) DIPEA (0,35 ml) lades till blandningen i en del, omedelbart följd av tillsats av solutipå av TFA-salt kvistar i NMP (se 2.8), och blandningen var kvar över natten under omrörning.
2,12) Blandningen hälldes i 3% aq. NaCl (350 ml), och den resulterande fällningen samlades in genom centrifugering och tvättas med vatten, MeOH och Et 2 O av repetitiva fjädring / centrifugering ge målet porfyrinenheter-dendrimer.
2,13) för att hydrolysera det perifera estergrupper var dendrimer först behandlas med NME 4 OH (~ 5 mm) i DMSO / MeOH under 20-60 minuter, följt av det fullständiga lösningsmedlet tas bort. Detta förfarande gjorde att vi kunde skapa dendrimererna med tillräckligt antal karboxylat grupper att ge vattenlöslighet. För att slutföra hydrolys var dendrimer behandlades med 0,1 N vattenlösning NaOH (över natten). Som ett resultat kunde rent porfyrin-dendrimer karboxylsyror isoleras i 80-95% avkastning.
Ändring av dendrimer periferin. Vid det här laget, med start från samma porphyrin-dendrimer, antingen en-eller två-photon prober kan syntetiseras. I det första fallet är alla perifera karboxylgrupper modifierad med PEG-enheter - en metod som kallas PEGylering. I det senare fallet finns flera karboxylgrupper first tillsammans med två-photon antenn kromoforer (kumarin-343) modifierad med etylendiamin (EDA) linkers, följt av PEGylering av återstående carboxyls [6]. Dendrimererna var PEGylerat med monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av. MW 1000) med hjälp av HBTU / DIPEA koppling kemi.
2.14) Till en lösning av kvistar i NMP (eller DMF) (1-10 mm) 1,25 gånger högre än HBTU lades till och reaktionsblandningen rördes vid RT i 10 min. 6,25-Vik över DIPEA lades, följt av omedelbar tillägg av 1,25 gånger högre än m-PEG-NH2. Reaktionsblandningen rördes under 2 dagar på RT. Dietyleter lades till reaktionsblandningen, var bildades fällning separeras genom centrifugering och åter fälls ut från THF genom tillsats av dietyleter.
2,15) Slutlig rening uppnåddes med storlek-utanförskap kromatografi med uttag av första front fasen. PEGylerat porfyrin-dendrimer upplöstes i en liten mängd THF (~ 15 ml) och lastas på toppen av en kromatografisk kolonn fylld med polystyren SEK fas (Biorad, Biobeads S-X1). Kolumnen var elueras med ren THF, och de mörka färgade bandet rör sig med fronten samlades in.
2,16) THF togs bort i rotationsindunstare och resterande materialet torkas i vakuum.
3. Probe karakterisering
Fotofysiska karakterisering inkluderar mätningar av sondens absorption och emission spektra fosforescens livstid τ 0 och Stern-Volmer syre släcka konstanter k q under fysiologiska förhållanden.
3,1) för absorption och emission spektra erhålls under normala förhållanden med hjälp av vanliga instrument (spektrofotometer och stadig fluorometer). ~ 1 mikroM lösningar av sonden används.
3,2) Nästa är Stern-Volmer kalibreringskurva som erhållits. Detta är den viktigaste mätningen, eftersom det tillåter oss att relatera livstid av sonden till syrgaskoncentrationen.
3,3) En lösning av sonden i PBS-buffert (pH 7,2) placeras i en speciell cylindrisk kyvett, som är placerad inne i temperaturkontrollerade kammare, som ligger inne i en ljus-tätt bur med portar för excitation och utsläpp optiska fibrer. Fibrerna bringas i nära kontakt med kyvetten i kammaren i rätt vinkel geometri.
3,4) Kuvetten är försluten med en propp, där en mycket känslig Clark-typ syre elektrod (CK-syre elektrod) är isatt. Korken innehåller också två nålar portar för in-och utlopp av argon. Elektroden är nedsänkt i lösningen, medan nålar enbart ge för flödet av gasflödet ovanför lösningen ytan. I början är argon inte ansluten till inloppet.
3,5) Temperaturen är inställd på önskat värde (vanligen 36-37 ° C) och lösningen är kvar under omrörning i jämvikt.
3,6) Den excitation fibern är ansluten till excitation-porten på en digital phosphorometer, som drivs av en dator. Ljuskällan i phosphorometer är en högeffekts LED, vars produktion styrs av en 333 kHz D / A ombord. Emissionen fiber är ansluten till en annan optisk port för phosphorometer, som är kopplad till en mycket infraröd-känslig APD (lavin fotodiod). Resultatet av den dioden förstärks och matas in i A / D-kanal av samma styrkort, vilket möjliggör synkronisering mellan excitation och kanaler utsläpp.
3,7) Kontrollen programvara albottenrekord generation av excitation pulser av önskad längd (t.ex. 5 eller 10 ms), följt av samling fosforescens förfall under en vald godtycklig period (vanligen 2-3 ms). Tid som behövs för en enda livstid mätning är typiskt 0,5-1 s, kan dock mätningar fås så snabbt som 10-20 per sekund.
3,8) Resultatet av det syre elektrod förstärks och leds in i en annan A / D ombord på samma dator. Detta är en låg frekvens styrelse (1 kHz max), som används för att spela in elektroden aktuell på utvalda tidsperioder. Programmet för att spela in elektroden uppgifter körs samtidigt med phosphorometer programvaran.
3,9) När lösningen temperaturen jämvikt, är både phosphorometer och programmen elektroden initieras samtidigt för att utföra mätningar var 10: s. Deras utgångar loggas synkront i två separata filer. Efter det är argon ansluten till inloppet på kyvetten proppen.
3,10) Som argon rinner över ytan på rörs lösning, ersätter den gradvis syre. Detta resulterar i en minskning av elektroden nuvarande och en ökning av fosforescens livstid, som mäts av phosphorometer. Vanligtvis är syre fördrivna utgör lösningen helt efter ca 2 timmar, under vilken tid uppgifterna helt automatiskt loggas in filer.
3,11) efter utgången av titreringen köra, är elektroden data och fosforescens livslängd importeras till en vanlig analys program (t.ex. Miocrocal Origin). Elektroden ström beror linjärt på syrehalt, och för den elektrod som används är praktiskt taget noll noll syre. Vid atmosfärstryck är PO 2 känt (ca 150 mm Hg). Således kan elektroden data direkt omvandlas till syre skala, och handlingen av inverterade fosforescens livstid vs PO 2 kan konstrueras. Denna tomt är utrustad med en rak linje med minsta-kvadrat-metoden för att ge syrgas härdning konstant KQ som dess lutning. Fosforescens livstid t0 erhålls antingen från samma plats (som inversen av axeln) eller direkt från mätning till noll-syre.
3,12) Om detta krävs, är titrering upprepas med en lösning av sonden i närvaro av albumin - ett protein som finns i blodplasman i höga koncentrationer, - för att efterlikna villkoren uppfylls i den verkliga experimentella system (Blod av djur in vivo). Erhåll Stern-Volmer tomter bör vara identiska om dendrimer skyddar givaren väl och PEG grupper isolerar sonden från kontakter med albumin. Annars kommer sonden och proteiner i blodet samverkar, och det kommer att leda till en förändrad Stern-Volmer tomt, vilket orsakar otydlighet i syre mätningar.
Erhållna kalibreringskonstanter används i bildbehandling experiment där syrehalterna är på förhand okända.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Stöd av bidragen EB007279 och HL081273 från NIH USA är tacksamt erkänns.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-methylpyrrolidinone | NMP | ||
| trifluoroacetic acid | TFA | ||
| diisopropylethylamine | DIPEA | ||
| 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate | HBTU | ||
| dimethylsulfoxide | DMSO | ||
| CDMT=1-chloro-3,5-dimethoxytriazine | CDMT | ||
| NMM=N-methylmorfoline | NMM |
References
- Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
- Lebedev, A. Y. Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems. Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).
- Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins. Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).
- Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions. Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).
- Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen. J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).
