Summary
We presenteren de beginselen van zuurstof metingen door fosforescentie afschrikken en herziening ontwerp van porfyrine-op basis van dendritische nanosensoren voor zuurstof imaging in biologische systemen.
Abstract
Zuurstof meting door fosforescentie afschrikken [1, 2] bestaat uit de volgende stappen: 1) de sonde wordt geleverd in het medium van belang (bijv. bloed of interstitiële vloeistof), 2) het object wordt verlicht met het licht van de juiste golflengte te prikkelen de sonde in zijn triplet toestand, 3) de uitgezonden fosforescentie wordt verzameld, en het tijdsverloop is geanalyseerd om de fosforescentie levensduur, die wordt omgezet in de zuurstofconcentratie (of de partiële druk, PO opbrengst
Protocol
1. Algemene beschrijving van zuurstof meetprotocol
(Deze sectie heeft geen actie, maar is cruciaal voor het begrijpen van de rest van het papier. Het kan worden gefilmd, bijvoorbeeld als een opeenvolging van een aantal Power Point dia's, vergezeld van de stem.)
1.1) De sonde wordt geleverd in het medium van belang, bijvoorbeeld, geïnjecteerd in het bloed of interstitiële vloeistof van een dier.
1.2) Het object (oppervlak van het weefsel) wordt verlicht met het licht van de juiste golflengte om de sonde te bevorderen in de aangeslagen triplet toestand. Typisch excitatie vindt plaats via de een-foton-mechanisme. Echter, in het geval van speciale twee-foton-enhanced probes, kan excitatie worden gedaan via de twee-foton mechanisme, die het mogelijk maakt met behulp van de sondes in de hoge-resolutie microscopie toepassingen. Een-foton excitatie levert over het algemeen minder ruimtelijke resolutie, maar vereist eenvoudiger instrumentatie en kan gebruikt worden in single-point metingen met LED-gebaseerde glasvezel phosphorometers.
1.3) Fosforescentie uitgezonden door de sonde is afkomstig van de langlevende triplet toestand. De sonde molecule moet speciaal worden ontworpen om hoge quantum opbrengst van de triplet toestand te geven en uit te stoten fosforescentie in plaats van fluorescentie. Terwijl in de triplet toestand, kan de sonde ervaring botsing ontmoetingen met moleculen van zuurstof, wat kan de-activeren van de triplet state - ". Quenching" een proces genaamd In de afwezigheid van zuurstof, de levensduur van de triplet toestand, en dus van de fosforescentie verval, is τ 0. In de aanwezigheid van zuurstof, is de fosforescentie levensduur (τ), verkort als gevolg van het blussen. Er is een directe relatie tussen de levensduur van de triplet staat en de hoeveelheid zuurstof in het milieu. Dit is de bekende Stern-Volmer relatie, die de levensduur (τ) van de fosforescentie verbindt met zuurstof-concentratie [O 2] (of partiële zuurstofdruk pO 2):
In biologische systemen, zuurstof is veruit de meest effectieve quencher van fosforescentie, waardoor de fosforescentie blussen methode zeer selectief aan zuurstof.
1.4) Met het oog op de levensduur t te meten, worden de uitgezonden fotonen fosforescerende weggegooid in de tijd. Bijvoorbeeld, na de excitatie puls, kan 200 fotonen worden verzameld in de eerste 15 microseconden, 150 fotonen verzameld in de komende 15 microseconden, en zo verder, totdat er geen fotonen worden verzameld. De nummers in de bakken uitgezet tegen de tijd te geven de fosforescentie verval, dat wordt geanalyseerd om de levensduur τ opbrengst. In beeldvorming, wordt deze procedure toegepast in elke pixel van het beeld, wat resulteert in fosforescentie leven kaarten. Metingen van levens ongevoelig zijn voor de heterogeniteit van de sonde verdeling over het object, dat is gebruikelijk voor biologische monsters. Dus levens rapport alleen op zuurstof. Levensduur τ worden omgezet in zuurstof concentraties met behulp van de Stern-Volmer relatie.
2. Bouw van fosforescerende sondes
Fosforescerende sondes voor zuurstof metingen in biologische systemen bestaan uit fosforescerende chromoforen (cores), ingekapseld in kooien gebouwd van dendrimeren - zeer regelmatige hypervertakte polymeren [3]. Dendrimeren de bescherming van de kernen van interacties met de omgeving en de controle van de snelheid van zuurstof diffusie van de kernen, waardoor het mogelijk is om de gevoeligheid en dynamisch bereik van de sondes (k q in het Stern-Volmer relatie) te optimaliseren. De uiteinden van de dendrimeren worden gewijzigd met chemisch inert hydrofiele polyethyleenglycol (PEG) groepen, waardoor de probes sterk oplosbaar in water en het voorkomen van hun interacties met biologische macromoleculen.
Fosforescerende kernen van de sondes zijn Pt of Pd complexen van porfyrinen en π-uitgebreid porfyrinen. π-Uitgebreide porfyrinen zijn porfyrinen waarin pyrrool ringen zijn versmolten met externe aromatische fragmenten. π-uitbreiding maakt afstelling van de sondes spectroscopische eigenschappen te voldoen aan de eisen van een bepaalde beeldvorming toepassing (bijvoorbeeld microscopie versus tomografie). Als voorbeeld beschrijven we de synthese van Pd tetaaryltetrabenzoporphyrins (PdAr 4 TBP) [4]. PdAr 4 TBP's hebben krachtige absorptiebanden in het verre-rode deel van het spectrum en sterke fosforescentie, zeer geschikt voor biologische zuurstof metingen.
De synthese van PdAr 4 TBP's bestaat uit de volgende stappen:
2.1) Voorbereiding van tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) door Lindsey condensatie [5] van tetrahydroisoindole met gesubstitueerde benzaldehyden. Om een 0,01 M oplossing van tetrahydroisoindole (1 eq) in CH <sub> 2 CL 2 de aromatische aldehyde (1 eq) werd toegevoegd onder argon. Het reactiemengsel werd geroerd gedurende 10 minuten in het donker bij RT BF 3 xEt 2 O (0,2 eq) werd toegevoegd en het reactiemengsel werd geroerd bij rt voor een extra 2 uur DDQ (1 eq) werd toegevoegd en het mengsel werd gedurende een nacht onder voortdurend roeren. De oplossing werd gewassen met 10% aq Na 2 SO 3, 10% aq Na 2 CO 3, 5% aq HCl en uiteindelijk met pekel. De organische fase werd gedroogd over Na 2 SO 4, vervolgens geconcentreerd in vacuüm. Het residu werd gekristalliseerd uit CH 2 Cl 2 - tert-butyl ether mengsel aan te geven Ar 4 TCHP als groene poeder. De opbrengsten zijn ongeveer 50%.
2.2) Het inbrengen van Pd naar PdAr 4 TCHPs te verkrijgen. Free-base porfyrines (1 eq) werden behandeld met PdCl2 of Pd (OAc) 2 (1,2 eq) in refluxerende CH3CN in de aanwezigheid van een overmaat van Et3N (20 eq). De conversie werd gevolgd door de UV-vis spectroscopie (oplosmiddel CH 2 Cl 2-AcOH) en beschouwd als volledig na de Soret band van het dictaat bij 468-472 nm verdwenen. Het mengsel werd afgekoeld zijn, verdund met CH 2 Cl 2 en gefilterd door een dunne laag van Celite naar Pd (0) te verwijderen. Het oplosmiddel werd verdampt en het residu werd gezuiverd door chromatografie op silicagel kolom met behulp van CH 2 Cl 2 als oplosmiddel. Donker rood fractie werd verzameld, werd het oplosmiddel verdampt te geven doelgroep PdAr 4 TCHPs in vrijwel kwantitatieve opbrengst.
2.3) PdAr 4 TBP werden bereid door oxidatie van PdAr 4 TCHPs met de 2-voudige overmaat van DDQ (16 eq) in gerefluxed THF. Tijdens refluxen, de kleur veranderd van donker-rood tot diep-groen. Het oplosmiddel werd verdampt, het residu werd verdund met CH 2 Cl 2, gewassen met 10% aq Na 2 SO 3, water en pekel. De organische fase werd gedroogd over Na 2 SO 4 en geconcentreerd in vacuüm. Het residu werd gezuiverd door chromatografie op silicagel (eluens CH 2 Cl 2). De eerste donkergroene fractie werd verzameld, geconcentreerd in vacuüm tot 85-90% van de als blauw-groene poeder PdAr4TBP's geven.
2.4) Perifere ester groepen van Pd tetrakis-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) werden gehydrolyseerd met behulp van 10-voudige overmaat van KOH in 1% (v / v) water / THF bij kamertemperatuur. Het oplosmiddel werd gedecanteerd van de neerslag van de gevormde kaliumzouten van carbonzuur derivaten van PdAr4TBP's. De vaste stoffen werden opgelost in water, geroerd voor extra 2 uur, aangezuurd met conc. HCl tot pH ~ 4-5. De verkregen precipitaat werd geïsoleerd door centrifugeren, gewassen met water en gedroogd in vacuüm.
Het beschermen van dendronen. Elke afzonderlijke tak van de dendrimeer heet dendron. Het beschermen van dendronen zijn opgebouwd uit aryl-glycine (AG) bouwstenen. AG dendronen kan gemakkelijk worden gesynthetiseerd uit goedkope grondstoffen en geïsoleerd in hoge zuiverheid en de opbrengst door chromatografie-vrije methoden. Synthese van generatie 2 (G2) AG-dendron bestaat uit de volgende stappen:
2.4) Synthese van de bouwstenen, Boc-beschermd 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide en 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide, met behulp van de Fischer haloacyl halogenide-methode.
2.5) Koppeling van de bouwstenen met CDMT / NMM peptide-koppeling chemie.
2.6) protectie het middelpunt aminogroep door roeren de oplossing van de G2 dendron in TFA gedurende 2 uur bij RT
2.7) Voor de montage van de hogere generatie dendronen, zijn koppeling / ontscherming stappen herhaald.
Dendrimeer assemblage wordt bereikt door koppeling van de ontschermd dendronen om PdAr4TBP (of andere porfyrine) met de HBTU / DIPEA koppeling chemie.
2.8) Eerst worden de Boc-beschermende groepen verwijderd van de dendron. Bijvoorbeeld, was Boc-beschermd G3 dendron (0,58 g) opgelost in TFA (15 ml), en het mengsel werd overgelaten aan bij RT reageren 2u. Het zuur werd verwijderd door roterende verdamping, waardoor de dendron als de TFA-zout. Het residu werd opgelost in droge NMP (10 ml) en een paar druppels van DIPEA werden toegevoegd, om de sporen van TFA lessen.
2.9) Voordat de koppeling reactie, is het essentieel om volledig op te lossen de porfyrine. Zo werd Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0.061 g) opgelost in droge NMP (65 ml) onder verhitting bij 140 ° C gedurende 10 min, onder stikstof stroom.
2,10) De oplossing werd afgekoeld tot kamertemperatuur, werd HBTU (0,211 g) toegevoegd en het mengsel werd geroerd gedurende 5 minuten.
2,11) DIPEA (0,35 ml) werd toegevoegd aan het mengsel in een portie, onmiddellijk gevolgd door de toevoeging van de solutieen van TFA-zout van de dendron in NMP (zie 2.8), en het mengsel werd gelaten 's nachts onder roeren.
2,12) Het mengsel werd uitgegoten in 3% aq. NaCl (350 ml), en het resulterende precipitaat werd verzameld door centrifugatie en gewassen met water, MeOH, en Et 2 O door repetitieve vering / centrifugeren om het doel porfyrine-dendrimeer opbrengst.
2,13) naar de perifere estergroepen hydrolyseren, was het dendrimeer eerst behandeld met NMe 4 OH (~ 5 mm) in DMSO / MeOH gedurende 20-60 min, gevolgd door de volledige verwijdering van het oplosmiddel. Deze procedure liet ons toe om dendrimeren te genereren met een voldoende aantal carboxylaatgroepen om oplosbaarheid in water te geven. Ter voltooiing van de hydrolyse, was de dendrimeer behandeld met 0,1 N waterige NaOH ('s nachts). Als gevolg hiervan kon pure porfyrine-dendrimeer carbonzuren worden afgezonderd in een 80-95% rendement.
Wijziging van de dendrimeer periferie. Op dit punt, uitgaande van dezelfde porfyrine-dendrimeer, ofwel een-of twee-foton sondes kunnen worden gesynthetiseerd. In het eerste geval worden alle de perifere carboxylgroepen gemodificeerd met PEG-eenheden - een methodologie die bekend staat als PEGylering. In het laatste geval worden meerdere carboxylgroepen eerst gekoppeld met twee-foton antenne chromoforen (Cumarine-343), gewijzigd met ethyleendiamine (EDA) linkers, gevolgd door PEGylering van de resterende carboxyls [6]. Dendrimeren waren gePEGyleerde met behulp van monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av. MW 1000) met behulp van HBTU / DIPEA koppeling chemie.
2,14) Aan een oplossing van de dendron in NMP (of DMF) (1-10 mm) 1,25-voudige overmaat van HBTU werd toegevoegd en het reactiemengsel werd geroerd bij kamertemperatuur 10 minuten. 6,25-voudige overmaat van DIPEA werd toegevoegd, gevolgd door de directe toevoeging van 1,25-voudige overmaat van m-PEG-NH2. Het reactiemengsel werd geroerd gedurende 2 dagen bij kamertemperatuur. Diethylether werd toegevoegd aan het reactiemengsel, werd de gevormde neerslag gescheiden door centrifugeren en opnieuw neergeslagen uit THF door het toevoegen van diethylether.
2,15) Final zuivering werd bereikt met size-exclusion chromatografie door het verzamelen van de eerste fase van front. GePEGyleerde porfyrine-dendrimeer werd opgelost in een kleine hoeveelheid THF (~ 15 ml) en geladen op de top van een chromatografische kolom gevuld met polystyreen SEC fase (Biorad, Biobeads S-X1). De kolom werd geëlueerd met pure THF, en de donkere gekleurde band bewegen met de voorkant werd verzameld.
2,16) THF werd verwijderd op een roterende verdamper, waarna het resterende materiaal werd gedroogd in een vacuüm.
3. Probe karakterisering
Fotofysische karakterisering omvat metingen van absorptie en emissie van de sonde spectra, fosforescentie levens τ 0 en Stern-Volmer zuurstof quenching constanten k q onder fysiologische omstandigheden.
3.1) De absorptie en emissie spectra worden verkregen onder omgevingsomstandigheden met behulp van standaard instrumenten (spectrofotometer en gestage fluorometer). ~ 1 uM oplossingen van de sonde wordt gebruikt.
3.2) Vervolgens wordt de Stern-Volmer kalibratie plot verkregen. Dit is de meest belangrijke meting, omdat het ons toelaat om de levensduur van de sonde hebben betrekking op de zuurstofconcentratie.
3.3) Een oplossing van de sonde in PBS-buffer (pH 7,2) is geplaatst in een speciale cilindrische cuvet, die is geplaatst in de temperatuur gecontroleerde ruimte, bevindt zich in een licht-ondoorlaatbare kooi met poorten voor excitatie en emissie optische vezels. De vezels worden gebracht in nauw contact met de cuvet in de kamer in de juiste hoek geometrie.
3.4) De cuvette wordt afgesloten met een stop, waarin een zeer gevoelige Clark-type zuurstof elektrode (CK-zuurstof elektrode) is geplaatst. De stop bevat ook twee naald-poorten voor inlaat en uitlaat van argon. De elektrode wordt ondergedompeld in de oplossing, terwijl de naalden alleen maar zorgen voor de stroom van de gasstroom boven de oplossing oppervlak. In eerste instantie is argon niet aangesloten op de inlaat.
3.5) De temperatuur wordt ingesteld op de gewenste waarde (meestal 36-37 ° C) en de oplossing is gelaten onder roeren gedurende evenwicht.
3.6) De excitatie vezel is aangesloten op de excitatie-poort van een digitale phosphorometer, bediend door een PC. De lichtbron in de phosphorometer is een high-power LED, waarvan de productie wordt gecontroleerd door een 333 kHz D / A-board. De emissie vezel is verbonden met een andere optische poort van de phosphorometer, die is gekoppeld aan een uiterst gevoelige infrarood-APD (lawine fotodiode). De uitgang van de diode wordt versterkt en gevoed in de A / D-kanaal van dezelfde controle bestuur, dat synchronisatie tussen de excitatie en emissie-kanalen mogelijk maakt.
3.7) De controle software aldieptepunten generatie van excitatie pulsen van elke gewenste lengte (bijvoorbeeld 5 of 10 ms), gevolgd door verzameling van fosforescentie verval tijdens een willekeurig gekozen periode (meestal 2-3 ms). Tijd die nodig is voor een enkel leven meting is typisch 0.5-1 s, echter, kan de metingen zo snel worden verkregen als 10-20 per seconde.
3.8) De uitgang van de zuurstof elektrode wordt versterkt en gericht in een andere A / D-board op dezelfde pc. Dit is een lage frequentie board (1 kHz max), die wordt gebruikt om de elektrode stroom op een bepaalde tijdsspanne te nemen. Het programma voor het opnemen van de elektrode gegevens loopt gelijktijdig met de phosphorometer software.
3.9) Zodra de oplossing temperatuur evenwicht, worden zowel de phosphorometer en de elektrode programma's geïnitialiseerd op hetzelfde moment uit te voeren metingen elke 10 s. Hun uitgangen zijn synchroon ingelogd in twee afzonderlijke bestanden. Daarna wordt argon aangesloten op de inlaat-poort van de cuvet stop.
3.10) Omdat argon stroomt over het oppervlak van het geroerde oplossing, vervangt geleidelijk aan zuurstof. Dit resulteert in een afname van de elektrode de huidige en een toename van de fosforescentie leven, die wordt gemeten door de phosphorometer. Meestal wordt zuurstof verdrongen vormen de oplossing volledig na ongeveer 2 uur, gedurende welke tijd de gegevens volledig worden automatisch gelogd in bestanden.
3.11) Na het einde van de titratie uitgevoerd, worden de elektrode gegevens en de fosforescentie levens geïmporteerd in een standaard analyse programma (bijv. Miocrocal Origin). De elektrode huidige lineair afhankelijk zuurstofconcentratie, en voor de elektrode wordt gebruikt is het praktisch nul op nul zuurstof. Bij atmosferische druk, is pO 2 bekend (ongeveer 150 mm Hg). Zo kan de elektrode gegevens rechtstreeks worden omgezet in de zuurstof-schaal, en de plot van inverse fosforescentie leven vs pO 2 kan worden geconstrueerd. Dit perceel is voorzien van een rechte lijn met behulp van de kleinste kwadraten methode om de zuurstof quenching constant kq als de helling te geven. Fosforescentie levensduur t0 wordt verkregen uit dezelfde passen (als het omgekeerde van de intercept), of direct van de meting bij nul-zuurstof.
3.12) Indien nodig, de titratie wordt herhaald met een oplossing van de sonde in de aanwezigheid van albumine - een eiwit aanwezig in het bloed plasma in hoge concentraties, - in om de voorwaarden na te bootsen ontmoetten elkaar in het echte experimentele systeem (het bloed van een dier in vivo). Het verkrijgen van Stern-Volmer percelen moet identiek zijn als de dendrimeer is het beschermen van de sonde goed en PEG groepen te isoleren van de sonde van de contacten met albumine. Anders zal de sonde en de eiwitten in het bloed interactie, en dat zal leiden tot een gewijzigde Stern-Volmer plot, waardoor onduidelijkheid in zuurstof metingen.
Aldus verkregen calibratie constanten worden gebruikt in de beeldvorming experimenten waarbij de zuurstof concentraties a priori onbekend.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ondersteuning van de subsidies EB007279 en HL081273 van de NIH VS is dankbaar erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-methylpyrrolidinone | NMP | ||
| trifluoroacetic acid | TFA | ||
| diisopropylethylamine | DIPEA | ||
| 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate | HBTU | ||
| dimethylsulfoxide | DMSO | ||
| CDMT=1-chloro-3,5-dimethoxytriazine | CDMT | ||
| NMM=N-methylmorfoline | NMM |
References
- Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
- Lebedev, A. Y. Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems. Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).
- Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins. Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).
- Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions. Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).
- Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen. J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).
