Summary
Nous présentons les principes de mesures d'oxygène par trempe phosphorescence et la conception de la révision à base de porphyrine nanocapteurs dendritiques pour l'imagerie d'oxygène dans les systèmes biologiques.
Abstract
Mesure de l'oxygène par trempe phosphorescence [1, 2] est constituée des étapes suivantes: 1) la sonde est livrée dans le milieu d'intérêt (par exemple le sang ou le liquide interstitiel), 2) l'objet est éclairé par une lumière de longueur d'onde appropriée afin d'exciter la sonde dans son état triplet, 3) la phosphorescence émise est collectée, et son cours du temps est analysée pour obtenir la durée de vie de phosphorescence, qui est converti en la concentration d'oxygène (ou pression partielle, pO
Protocol
1. Description générale du protocole de mesure de l'oxygène
(Cette section ne dispose pas de toute action, mais elle est cruciale pour comprendre le reste du papier. Il peut être filmé, par exemple, comme une séquence de quelques diapositives Power Point, accompagné par la voix.)
1.1) La sonde est livrée dans le milieu de l'intérêt, par exemple, injecté dans le sang ou de liquide interstitiel d'un animal.
1.2) L'objet (surface du tissu) est illuminée par la lumière de longueur d'onde appropriée, afin de promouvoir la sonde dans son état excité triplet. Typiquement l'excitation se fait via le mécanisme à un photon. Toutefois, dans le cas des particuliers à deux photons amélioré par les sondes, l'excitation peut se faire via le mécanisme à deux photons, qui permet d'utiliser des sondes dans les applications de la microscopie à haute résolution. Un photon d'excitation fournit généralement moins de résolution spatiale, mais nécessite plus simple instrumentation et peut être utilisé dans un seul point de mesure avec base de LED à fibre optique phosphorometers.
1.3) Phosphorescence émis par la sonde provient de l'état triplet de longue durée. La molécule sonde doit être spécialement conçu pour donner à haut rendement quantique de l'état triplet et émettent la phosphorescence au lieu de la fluorescence. Alors que dans l'état triplet, la sonde peut l'expérience de rencontres avec des molécules de collision de l'oxygène, qui peut désactiver l'état triplet - ". Trempe" un processus appelé En l'absence d'oxygène, la durée de vie de l'état triplet, et par conséquent de la désintégration de phosphorescence, est τ 0. En présence d'oxygène, la durée de vie de phosphorescence (τ) est raccourcie en raison de la trempe. Il ya une relation directe entre la durée de vie de l'état triplet et la quantité d'oxygène dans l'environnement. Ceci est bien connu de Stern-Volmer relation, qui relie la durée de vie (τ) de la phosphorescence de la concentration en oxygène [O 2] (ou pression partielle en oxygène pO 2):
Dans les systèmes biologiques, l'oxygène est de loin l'extincteur le plus efficace de la phosphorescence, ce qui rend le procédé de trempe phosphorescence très sélectif à l'oxygène.
1.4) En vue de mesurer la durée de vie t, les photons émis sont phosphorescentes binned dans le temps. Par exemple, après l'impulsion d'excitation, 200 photons pourraient être collectées dans les 15 premières microsecondes, 150 photons collectés dans les 15 prochaines microsecondes, et ainsi de suite, jusqu'à ce qu'il n'y photons sont recueillis. Les chiffres dans les bacs en fonction du temps donne la décomposition de phosphorescence, qui est analysé pour obtenir la durée de vie τ. En imagerie, cette procédure est appliquée dans chaque pixel de l'image, résultant dans des cartes à vie de phosphorescence. Les mesures de durées de vie sont insensibles aux hétérogénéités de la distribution de la sonde à travers l'objet, qui est commun pour les échantillons biologiques. Ainsi, la durée de vie seul rapport sur l'oxygène. Lifetimes τ sont convertis en concentrations d'oxygène en utilisant la relation de Stern-Volmer.
2. Construction de sondes phosphorescente
Phosphorescent sondes pour des mesures d'oxygène dans les systèmes biologiques consistent chromophores phosphorescentes (noyaux), encapsulée dans des cages construites des dendrimères - très régulières polymères hyperbranchés [3]. Les dendrimères de protéger les noyaux d'interactions avec l'environnement et le contrôle de la vitesse de diffusion de l'oxygène vers les noyaux, ce qui permet d'optimiser la sensibilité et la dynamique des sondes (constante k q dans la relation de Stern-Volmer). Les extrémités des dendrimères sont modifiés avec du polyéthylène glycol chimiquement inerte hydrophile (PEG) des groupes, ce qui rend les sondes hautement soluble dans l'eau et la prévention de leurs interactions avec les macromolécules biologiques.
Noyaux Phosphorescent des sondes sont des complexes Pt ou Pd de porphyrines et de π étendu porphyrines. π-étendue porphyrines sont des porphyrines dans laquelle les cycles pyrrole sont fusionnées avec des fragments aromatiques externes. π-Extension permet d'affiner les propriétés des sondes spectroscopiques pour satisfaire aux exigences d'une application d'imagerie en particulier (par exemple la microscopie vs tomographie). Comme exemple, nous décrivons la synthèse de tetaaryltetrabenzoporphyrins Pd (PDAR 4 TBP) [4]. PDAR 4 TBP ont des bandes d'absorption puissante dans la partie rouge lointain du spectre et la phosphorescence forte, bien adapté pour des mesures d'oxygène biologique.
La synthèse de PDAR 4 TBP est constituée des étapes suivantes:
2.1) Préparation de tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) par Lindsey condensation [5] de tetrahydroisoindole avec benzaldéhydes substitués. Pour une solution 0,01 M d'tetrahydroisoindole (1 éq) dans le CH <sub> 2 Cl 2 de l'aldéhyde aromatique (1 éq) a été ajouté sous argon. Le mélange réactionnel a été agité pendant 10 min dans le noir à température ambiante BF 3 O XET 2 (0,2 éq) a été ajouté et le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pour une période supplémentaire 2 h. DDQ (1 éq) a été ajouté et le mélange a été laissé pendant une nuit sous agitation continue. La solution a été lavée avec 10% aq Na 2 SO 3, 10% aq Na 2 CO 3, 5% aq HCl et enfin avec de la saumure. La phase organique a été séchée sur Na 2 SO 4, puis concentrée sous vide. Le résidu est recristallisé dans CH 2 Cl 2 - mélange d'éther de tert-butyle à donner Ar 4 TCHP que de la poudre verte. Les rendements sont d'environ 50%.
2.2) L'insertion de Pd pour obtenir PDAR 4 TCHPs. Free-base de porphyrines (1 eq) ont été traités avec PdCl 2 ou Pd (OAc) 2 (1,2 éq) dans le reflux CH 3 CN en présence d'un excès de Et 3 N (20 éq.) La conversion a été suivie par spectroscopie UV-Vis (solvant CH 2 Cl 2-AcOH) et considérée comme complète après la bande de Soret de dictée à 468-472 nm disparu. Le mélange a été autorisé à se refroidir, dilué avec du CH 2 Cl 2 et filtrée à travers une fine couche de célite pour enlever Pd (0). Le solvant est évaporé et le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice en utilisant CH 2 Cl 2 comme solvant. Sombre fraction rouges ont été recueillies, le solvant est évaporé pour donner cibles PDAR 4 TCHPs un rendement presque quantitatif.
2.3) PDAR 4 TBP ont été préparés par oxydation des PDAR 4 TCHPs avec l'excès de 2-fold de DDQ (16 éq) dans le THF au reflux. Pendant le reflux, la couleur a changé à partir d'un rouge foncé à un vert profond. Le solvant est évaporé, le résidu est dilué avec du CH 2 Cl 2, lavé avec 10% aq Na 2 SO 3, de l'eau et de saumure. La phase organique a été séchée sur Na 2 SO 4 et concentrée dans le vide. Le résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant CH 2 Cl 2). Le premier de couleur vert foncé fraction a été recueillie, concentrée sous vide pour donner 85-90% de poudre bleu-vert de PdAr4TBP.
2.4) groupes ester périphérique de Pd tétrakis-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) ont été hydrolyses en utilisant 10 fois plus de KOH dans 1% (v / v) eau / THF à température ambiante. Le solvant a été décanté du précipité des sels de potassium formé de dérivés d'acide carboxylique de l'PdAr4TBP. Les solides ont été dissous dans l'eau, on agite pendant 2 h supplémentaires, acidifié avec HCl conc. HCl à pH ~ 4-5. Le précipité obtenu a été isolé par centrifugation, lavé à l'eau et séché dans le vide.
Protéger dendrons. Chaque branche du dendrimère est appelée dendron. Protéger dendrons sont construits à partir de la glycine-aryle blocs de construction (AG). Dendrons AG peuvent être facilement synthétisés à partir de matières premières peu coûteuses et isolés dans une grande pureté et le rendement par chromatographie sans méthodes. Synthèse de la génération 2 (G2) AG-dendron comprend les étapes suivantes:
2.4) Synthèse des blocs de construction, Boc-protégé 3,5-dicarboxyphényl glycineamide et le 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide, en utilisant la méthode Fischer haloacyle halogénures.
2.5) Couplage des blocs de construction en utilisant CDMT / NMM la chimie de couplage peptidique.
2.6) déprotéger le groupe focal aminés en agitant la solution de l'dendron G2 dans du TFA pendant 2 h à température ambiante
2.7) Pour l'assemblage du dendrons de génération supérieure, couplage / déprotection étapes sont répétées.
Dendrimère assemblage est réalisé par couplage de la dendrons déprotégé pour PdAr4TBP (ou d'autres porphyrines) en utilisant la chimie de couplage HBTU / DIPEA.
2.8) En premier lieu, les groupes de protection Boc sont retirés du dendron. Par exemple, Boc-protégé dendron G3 (0,58 g) a été dissous dans du TFA (15 ml), et le mélange a été laissé à réagir à température ambiante pendant 2h. L'acide a été éliminé par évaporation rotative, ce qui donne l'dendron que le TFA-sel. Le résidu est dissous dans la NMP à sec (10 ml) et quelques gouttes de DIPEA ont été ajoutés, pour étancher les traces de TFA.
2.9) Avant de commencer la réaction de couplage, il est essentiel de dissoudre complètement la porphyrine. Par exemple, Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0,061 g) est dissous dans la NMP à sec (65 ml) sous chauffage à 140 ° C pendant 10 min, sous flux d'azote.
2.10) La solution a été refroidie à température ambiante, HBTU (0,211 g) a été ajouté et le mélange a été agité pendant 5 min.
2.11) DIPEA (0,35 ml) a été ajoutée au mélange en une seule portion, immédiatement suivie par l'addition de l'solutisur de TFA-sel de la dendron dans la NMP (voir 2.8), et le mélange a été laissé pendant une nuit sous agitation.
2.12) Le mélange est versé dans 3% aq. NaCl (350 ml), et le précipité résultant est recueilli par centrifugation et lavé à l'eau, MeOH, et Et 2 O par la suspension répétitives / centrifugation pour produire la cible porphyrine-dendrimère.
2,13) pour hydrolyser les groupes ester périphériques, le dendrimère a d'abord été traités avec NMe 4 OH (~ 5 mM) dans le DMSO / MeOH plus 20-60 min période, suivie de l'élimination complète du solvant. Cette procédure nous a permis de générer des dendrimères à un nombre suffisant de groupes carboxylates de donner une solubilité aqueuse. Pour compléter l'hydrolyse, le dendrimère a été traité avec 0,1 NaOH aqueuse (une nuit). En conséquence, pur-porphyrine dendrimère acides carboxyliques peuvent être isolés dans des rendements de 80-95%.
Modification de la périphérie des dendrimères. A ce point, à partir de la même porphyrine-dendrimère, soit un ou deux photons sondes peuvent être synthétisées. Dans le premier cas, tous les groupes carboxyle périphériques sont modifiés avec des unités de PEG - une méthodologie connue sous le nom PEGylation. Dans ce dernier cas, plusieurs groupes carboxyle sont d'abord couplé avec chromophores antenne à deux photons (coumarine-343) modifié avec l'éthylènediamine (EDA) linkers, suivie par PEGylation des carboxyles restants [6]. Les dendrimères sont pégylé utilisant monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, av. MW 1000) en utilisant la chimie de couplage HBTU / DIPEA.
2,14) à une solution de dendron dans la NMP (ou DMF) (1-10 mM) excès de 1,25 fois de HBTU a été ajouté et le mélange réactionnel a été agité à TA pendant 10 min. Excès de 6,25 fois de DIPEA a été ajouté, suivi par l'ajout immédiat d'un excès de 1,25 pli de m-PEG-NH2. Le mélange réactionnel a été agité pendant 2 jours à température ambiante. L'éther diéthylique a été ajouté au mélange réactionnel, le précipité formé a été séparé par centrifugation et re-précipité du THF par addition d'éther éthylique.
2.15) de purification finale a été réalisé avec chromatographie d'exclusion stérique par la collecte de la phase de l'avant première. Pégylé porphyrine-dendrimère a été dissous dans une petite quantité de THF (~ 15 ml) et chargé sur le sommet d'une colonne chromatographique remplie de polystyrène SEC phase (Biorad, Biobeads S-X1). La colonne a été éluée avec du THF pur, et la bande de couleur foncée se déplaçant avec la première a été recueillie.
2.16) THF a été éliminé sur un évaporateur rotatif, et le matériel restant a été séché sous vide.
3. La caractérisation de la sonde
Caractérisation photophysiques comprend des mesures de spectres de la sonde d'absorption et d'émission, la phosphorescence vies τ 0 et de Stern-Volmer oxygène trempe constantes k q dans des conditions physiologiques.
3.1) Les spectres d'absorption et d'émission sont obtenus dans des conditions ambiantes en utilisant une instrumentation standard (spectrophotomètre et fluorimètre stable). ~ 1 uM solutions de la sonde est utilisée.
3.2) Ensuite, l'intrigue de calibration de Stern-Volmer est obtenu. C'est la mesure la plus importante, car elle nous permet de relier la durée de vie de la sonde à la concentration en oxygène.
3.3) Une solution de la sonde dans le tampon PBS (pH 7,2) est placé dans une cuvette spéciale cylindrique, qui est positionné à l'intérieur de la chambre à température contrôlée, situé à l'intérieur d'une cage de lumière imperméable avec des ports pour les fibres d'excitation et d'émission optique. Les fibres sont mises en contact étroit avec la cuvette dans la chambre de la géométrie à angle droit.
3.4) La cuvette est fermée par un bouchon, dans lequel une électrode à oxygène hautement sensible de type Clark (CK-électrode à oxygène) est inséré. Le bouchon contient également deux ports de seringues pour les entrée et sortie de l'argon. L'électrode est immergée dans la solution, alors que les aiguilles fournissent simplement pour l'écoulement du flux de gaz au-dessus de la surface de solution. Dans un premier temps, l'argon n'est pas relié à l'entrée.
3.5) La température est réglée à la valeur désirée (généralement 36-37 ° C) et la solution est laissée sous agitation pour l'équilibrage.
3.6) La fibre d'excitation est connectée au port d'excitation d'un phosphorometer numérique, géré par un PC. La source de lumière dans le phosphorometer est une LED haute puissance, dont la sortie est contrôlé par un 333 kHz / D Un conseil d'administration. La fibre d'émission est connecté à un autre port optique de la phosphorometer, qui est couplé à une APD très sensible à l'infrarouge (photodiode à avalanche). La sortie de la diode est amplifié et nourri dans le A / canal D de la Commission de contrôle de même, ce qui permet la synchronisation entre l'excitation et les canaux d'émission.
3.7) Le logiciel de contrôle collla génération d'impulsions d'excitation bas de n'importe quelle longueur désirée (par exemple 5 ou 10 ms), suivie par la collecte de la décadence de phosphorescence pendant toute période choisie arbitrairement (généralement 2-3 ms). Temps nécessaire pour une mesure de la durée de vie est généralement de 0,5 à 1 seule s, cependant, les mesures peuvent être obtenus aussi rapidement que 10-20 par seconde.
3.8) La sortie de l'électrode à oxygène est amplifié et dirigé dans un autre Un conseil / D sur le même PC. Ceci est un conseil de basse fréquence (1 kHz max), qui est utilisé pour enregistrer le courant d'électrode à des périodes choisies. Le programme d'enregistrement des données d'électrode fonctionne simultanément avec le logiciel phosphorometer.
3.9) Une fois que la température de la solution est équilibré, les deux phosphorometer et les programmes d'électrode sont initialisées dans le même temps d'effectuer des mesures toutes les 10 s. Leurs sorties sont enregistrées de manière synchrone en deux fichiers séparés. Après cela, l'argon est relié à l'orifice d'entrée sur le bouchon cuvette.
3.10) que l'argon s'écoule sur la surface de la solution agitée, il remplace progressivement l'oxygène. Il en résulte une diminution du courant d'électrode et une augmentation de la durée de vie de phosphorescence, qui est mesurée par le phosphorometer. Habituellement, l'oxygène est déplacé former la solution entièrement après environ 2 h, période pendant laquelle les données sont entièrement automatiquement connecté en fichiers.
3,11) Après la fin de la course de titrage, les données d'électrode et la durée de vie de phosphorescence sont importés dans un programme d'analyse standard (par exemple origine Miocrocal). Le courant d'électrode dépend linéairement de la concentration en oxygène, et pour l'électrode utilisée, il est pratiquement zéro à zéro oxygène. À la pression atmosphérique, la pO 2 est connue (environ 150 mm Hg). Ainsi, les données d'électrode peuvent être directement transposable à l'échelle d'oxygène, et l'intrigue de la durée de vie de phosphorescence inverse vs pO 2 peuvent être construits. Cette parcelle est équipée d'une ligne droite en utilisant la méthode des moindres carrés pour donner de l'oxygène constante KQ trempe que sa pente. Durée de vie de phosphorescence t0 est obtenu soit à partir du même ajustement (comme l'inverse de l'interception) ou directement à partir de la mesure à zéro oxygène.
3.12) Si nécessaire, le titrage est répété en utilisant une solution de la sonde dans la présence d'albumine - une protéine présente dans le plasma sanguin à des concentrations élevées, - afin d'émuler les conditions rencontrées dans le système réel expérimental (sang d'un animal in vivo). L'obtention de Stern-Volmer parcelles doivent être identiques si le dendrimère est de protéger la sonde bien et groupes PEG isoler la sonde à partir de contacts avec l'albumine. Sinon, la sonde et les protéines dans le sang va interagir, et qui va conduire à une modification de Stern-Volmer intrigue, provoquant une ambiguïté dans les mesures de l'oxygène.
Constantes d'étalonnage ainsi obtenues sont utilisées dans des expériences d'imagerie où les concentrations d'oxygène sont a priori inconnu.
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Acknowledgments
Soutien de l'EB007279 subventions et HL081273 NIH des Etats-Unis est grandement appréciée.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-methylpyrrolidinone | NMP | ||
| trifluoroacetic acid | TFA | ||
| diisopropylethylamine | DIPEA | ||
| 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate | HBTU | ||
| dimethylsulfoxide | DMSO | ||
| CDMT=1-chloro-3,5-dimethoxytriazine | CDMT | ||
| NMM=N-methylmorfoline | NMM |
References
- Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
- Lebedev, A. Y. Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems. Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).
- Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins. Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).
- Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions. Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).
- Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen. J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).
