Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

סינתזה כיול nanoprobes זרחני עבור הדמיה חמצן במערכות ביולוגיות

Published: March 3, 2010 doi: 10.3791/1731

Summary

אנו מציגים עקרונות של מדידות חמצן על ידי מרווה זרחני ועיצוב סקירה של porphyrin מבוססי nanosensors הדנדריטים הדמיה חמצן במערכות ביולוגיות.

Abstract

מדידת חמצן על ידי מרווה זרחני [1, 2] מורכב מהשלבים הבאים: 1) בדיקה מועבר לתוך המדיום של עניין (למשל דם או נוזל interstitial); 2) את האובייקט מואר עם אור באורך גל מתאים כדי להלהיב בדיקה למצב שלישיה שלה; 3) זרחני הנפלט נאסף, ואת כמובן הזמן שלו הוא ניתח להניב את חייו זרחני, אשר מומר ריכוז החמצן (או הלחץ החלקי, ת.ד.

Protocol

1. תיאור כללי של פרוטוקול המדידה חמצן

(סעיף זה אין כל פעולה, אך הוא חיוני להבנת שאר הנייר. זה יכול להיות מצולם, למשל, רצף של כמה שקופיות נקודת חשמל, מלווה את קולו).

1.1) בדיקה מועבר לתוך המדיום של עניין, למשל, מוזרק נוזל דם או ביניים של חיה.

1.2) האובייקט (פני השטח של הרקמה) מואר באור באורך גל מתאים על מנת לקדם את החללית למצב שלישיה נרגש שלה. בדרך כלל עירור מתרחשת באמצעות מנגנון אחד הפוטון. עם זאת, במקרה של שני הפוטונים משופרת בדיקות מיוחדות, עירור ניתן לעשות זאת באמצעות מנגנון שני הפוטונים, המאפשרת באמצעות בדיקות ב ברזולוציה גבוהה יישומים במיקרוסקופ. אחת פוטון עירור בדרך כלל מספק רזולוציה מרחבית פחות, אבל דורש מכשור פשוט ניתן להשתמש נקודה אחת המדידות עם LED מבוססות סיבים אופטיים phosphorometers.

1.3) זרחני הנפלטת לחקור את מקורו המדינה האריכה ימים שלישיה. המולקולה בדיקה חייב להיות מתוכנן במיוחד כדי לתת תשואה גבוהה הקוונטים של המדינה שלישיה פולטים זרחני במקום פלואורסצנטי. בעוד המדינה שלישיה, החללית יכול לחוות מפגשים collisional עם מולקולות של חמצן, אשר יכול להפעיל את דה מדינה שלישיה - ". מרווה" תהליך הנקרא בהעדר חמצן, את חייו של המדינה שלישיה, ומכאן של ריקבון זרחני, הוא τ 0. בנוכחות חמצן, החיים זרחני (τ) מתקצר כתוצאה מרווה. יש קשר ישיר בין החיים של המדינה שלישיה ואת כמות החמצן בסביבה. זה ידוע שטרן Volmer יחסים, שמחבר את החיים (τ) של זרחני כדי ריכוז החמצן [O 2] (או בלחץ חמצן חלקי ת.ד. 2):

המשוואה

במערכות ביולוגיות, חמצן הוא ללא ספק מרווה היעילה ביותר זרחני, מה שהופך את השיטה מרווה זרחני סלקטיבית מאוד חמצן.

1.4) כדי למדוד את לא בחיים, הפוטונים הנפלטים זרחני הם זרקת לפח בזמן. לדוגמה, לאחר הדופק עירור, 200 פוטונים יכול להיות שנאספו ב -15 מיקרו הראשון, 150 הפוטונים שנאספו ב -15 מיקרו הבא, וכן הלאה, עד אין הפוטונים נאספים. המספרים פחי זממו נגד הזמן לתת את ריקבון זרחני, אשר ניתח את התשואה החיים τ. בתחום ההדמיה, הליך זה מוחל כל פיקסל של התמונה, והתוצאה היא מפות בחיים זרחני. מדידות של חיים אינם רגישים heterogeneities ההפצה בדיקה ברחבי האובייקט, אשר נפוץ דגימות ביולוגיות. לפיכך, חיים לדווח רק על חמצן. חיים τ מומרים ריכוזי חמצן באמצעות יחסים שטרן Volmer.

2. בניית חלליות זרחני

בדיקות זרחני למדידות חמצן במערכות ביולוגיות מורכבות chromophores זרחני (ליבות), מקופלת לתוך כלובים שנבנו של dendrimers - פולימרים hyperbranched קבוע מאוד [3]. Dendrimers להגן על ליבות מ אינטראקציות עם הסביבה לשלוט על קצב הדיפוזיה של חמצן ליבות, מה שהופך אותו ניתן לייעל את רגישות טווח דינמי של בדיקות (קבוע k q ביחסים שטרן Volmer). טרמיני של dendrimers הם שונה עם פוליאתילן גליקול אינרטי מבחינה כימית (PEG) קבוצות הידרופיליות, ביצוע בדיקות מאוד מסיס במים ומניעת הגומלין שלהם עם מקרומולקולות ביולוגיות.

ליבות זרחני של בדיקות הם Pt או Pd קומפלקסים של פורפירינים ו-π המורחבת פורפירינים. π-Extended פורפירינים הם פורפירינים בהם טבעות pyrrole הם התמזגו עם שברי ארומטיים חיצוני. הרחבה π-מאפשר כוונון של בדיקות המאפיינים ספקטרוסקופיות כדי לספק את הדרישות של יישום הדמיה מסוים (למשל מול טומוגרפיה מיקרוסקופית). כדוגמה, נתאר את הסינתזה של tetaaryltetrabenzoporphyrins Pd (PdAr 4 TBP) [4]. PdAr 4 של TBP יש להקות קליטה חזקה בחלק מרחיקות אדום של הספקטרום זרחני וחזק, גם מתאים מדידות חמצן ביולוגי.

סינתזה של PdAr 4 של TBP מורכב מהשלבים הבאים:

2.1) הכנת tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) על ידי לינדסי עיבוי [5] של tetrahydroisoindole עם benzaldehydes תחליף. כדי פתרון של 0.01 M tetrahydroisoindole (1 EQ) ב-CH <תת> 2 CL 2 אלדהיד ארומטיים (1 EQ) נוספה תחת ארגון. תערובת התגובה היה נרגש עבור 10 דקות בחושך ב RT BF 3 xEt 2 O (0.2 EQ) נוספה, ואת תערובת התגובה היה נרגש ב rt עבור תוספת 2 ח DDQ (1 EQ) נוספה, ואת תערובת נשאר ללון תחת בחישה מתמדת. הפתרון נשטף עם 10% aq Na 2 SO 3, 10% aq Na 2 CO 3, 5% aq HCl ולבסוף עם מי מלח. השלב האורגני היה מיובש על Na 2 SO 4, מרוכז אז בחלל ריק. שאריות היה recrystallized מ-CH 2 Cl 2 - טרט-בוטיל תערובת אתר לתת אר 4 TCHP כמו אבקה ירוקה. התשואות הן כ -50%.

2.2) החדרת Pd להשיג PdAr 4 TCHPs. חינם בסיס פורפירינים (1 EQ) טופלו PdCl 2 או Pd (OAc) 2 (1.2 EQ) ב refluxing CH 3 CN בנוכחות עודף של Et 3 N (20 EQ). ההמרה היה פיקוח על ידי ספקטרוסקופית UV-VIS (CH 2 Cl 2 ממס-AcOH) ונחשב להשלים אחרי הלהקה Soret של הכתבה על 468-472 ננומטר נעלם. התערובת הורשה להתקרר, מדולל CH 2 Cl 2 ו מסונן באמצעות שכבה דקה של Celite להסיר Pd (0). ממס היה התאדו, ואת שאריות היה מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה על עמודה סיליקה ג'ל באמצעות CH 2 Cl 2 כממיס. חלק אדום כהה נאסף, ממס היה התאדו לתת יעד PdAr 4 TCHPs בתשואה כמותי כמעט.

2.3) PdAr 4 של TBP הוכנו על ידי חמצון של PdAr 4 TCHPs עם עודף של פי 2 של DDQ (16 EQ) ב THF refluxed. במהלך refluxing, צבע שונה מ אדום כהה על ירוק עמוק. ממס היה התאדו, שאריות היה מדולל CH 2 Cl 2, שטף עם 10% aq Na 2 SO 3, מים מלח. השלב האורגני היה מיובש על Na 2 SO 4 ומרוכזת בריק. שאריות היה מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה על ג'ל סיליקה (eluent CH 2 Cl 2). חלק ראשון ירוק כהה נאסף, מרוכזים ואקום לתת 85-90% של אבקת כמו כחול ירוק של PdAr4TBP.

2.4) קבוצות אסתר היקפיים של Pd tetrakis-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) היו באמצעות הידרוליזה של פי 10 KOH עודף של 1% (v / v) מים / THF ב RT. ממס היה יצק מן המשקע של מלחי אשלגן נוצרו נגזרות של חומצה carboxylic PdAr4TBP של. היו מוצקים מומסים במים, עוררה עבור 2 שעות נוספות, acidified עם קונצרט כלשהו. ל ~ HCl pH 4-5. המשקע המתקבל היה מבודד על ידי צנטריפוגה, שטפתי עם מים יבשים בוואקום.

הגנה dendrons. האישיים של כל ענף dendrimer נקרא Dendron. Dendrons הגנה בנויים aryl-גליצין (AG) אבני הבניין. Dendrons AG ניתן להפיק בקלות מחומרים זולים החל מבודדים טוהר תשואה גבוהה על ידי כרומטוגרפיה ללא שיטות. סינתזה של דור 2 (G2) AG-Dendron מורכב מהשלבים הבאים:

2.4) סינתזה של אבני הבניין, BOC מוגן 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide ו 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide, באמצעות שיטת פישר haloacyl הליד.

2.5) מצמד של אבני הבניין באמצעות CDMT / כימיה המוזיאון צימוד פפטיד.

2.6) Deprotecting קבוצת אמינו מוקד ידי ערבוב של פתרון Dendron G2 ב TFA עבור 2 שעות על RT

2.7) עבור הרכבה של dendrons הדור גבוה יותר, צימוד / deprotection צעדים חוזרים.

Dendrimer הרכבה מושגת על ידי צימוד של dendrons deprotected כדי PdAr4TBP (או porphyrin אחרים) באמצעות כימיה HBTU / DIPEA צימוד.

2.8) ראשית, BOC-מגן הקבוצות יוסרו Dendron. לדוגמה, BOC מוגן Dendron G3 (0.58 גר ') היה מומס TFA (15 מ"ל), ואת תערובת נותר להגיב ב RT עבור 2h. חומצה הוסר על ידי אידוי סיבובית, מניב Dendron כמו מלח TFA. שאריות היה מומס NMP יבש (10 מ"ל) וכמה טיפות של DIPEA נוספו, כדי להרוות את עקבות TFA.

2.9) לפני שמתחילים את תגובת צימוד, הוא קריטי כדי לפרק את porphyrin לחלוטין. לדוגמה, Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0.061 גרם) היה מומס NMP יבש (65 מ"ל) חימום תת ב 140 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, תחת זרם חנקן.

2.10) הפתרון היה התקרר לטמפרטורת החדר, HBTU (0.211 גרם) נוספה, ואת תערובת היה נרגש עבור 5 דקות.

2.11) DIPEA (0.35 מ"ל) נוספה לתערובת בחלק אחד, ומיד לאחר מכן על ידי תוספת של solutiעל מלח-TFA של Dendron של NMP (ראו 2.8), ואת תערובת נשאר ללון תחת ערבוב.

2.12) התערובת נמזג aq 3%. NaCl (350 מ"ל), ואת המשקע שהתקבל נאסף על ידי צנטריפוגה ורחץ במים, MeOH ו Et 2 O על ידי השעיית חוזרות / צנטריפוגה להניב היעד porphyrin-dendrimer.

2.13) כדי hydrolyze הקבוצות אסתר הפריפריה, dendrimer טופל תחילה עם NME 4 OH (~ 5 mM) ב DMSO / MeOH במשך 20-60 דקות, ואחריו הסרת מלא ממס. הליך זה מאפשר לנו ליצור dendrimers עם מספר מספיק של קבוצות carboxylate לתת מסיסות מימית. כדי להשלים את הידרוליזה, dendrimer היה שטופלו מימית NaOH 0.1N (לילה). כתוצאה מכך, טהור porphyrin-dendrimer חומצות קרבוקסיליות יכול להיות מבודד התשואות 80-95%.

שינוי של הפריפריה dendrimer. בשלב זה, החל באותו porphyrin-dendrimer, או אחד או שני הפוטונים בדיקות יכול להיות מסונתז. במקרה הראשון, כל הקבוצות carboxyl היקפי משתנים עם יחידות PEG - מתודולוגיה המכונה PEGylation. במקרה האחרון, קבוצות carboxyl כמה הם מצמידים הראשון עם שני הפוטונים chromophores אנטנה (coumarin-343) שונה עם ethylenediamine (EDA) linkers, ואחריו PEGylation של carboxyls הנותרים [6]. Dendrimers היו PEGylated באמצעות monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av. MW 1000) באמצעות HBTU / DIPEA כימיה צימוד.

2.14) לפתרון של Dendron של NMP (או DMF) (10/01 mM) עודף של פי 1.25 HBTU נוספה, ואת תערובת התגובה היה נרגש ב RT במשך 10 דקות. עודף של פי 6.25 DIPEA נוסף, ואחריו תוספת מיידית של עודף של פי 1.25 מ-PEG-NH2. תערובת התגובה היה עבור עורר 2 ימים rt. אתר Diethyl נוספה תערובת התגובה, המשקע שנוצר הופרד על ידי צנטריפוגה מחדש זירז מ THF על ידי תוספת של אתר diethyl.

2.15) לטיהור הסופי הושג עם כרומטוגרפיה גודל הרחקה על ידי איסוף של שלב הכניסה הראשונה. PEGylated porphyrin-dendrimer היה מומס כמות קטנה של THF (~ 15 מ"ל) והעמסנו על החלק העליון של עמודת chromatographic מלא קלקר שלב ה-SEC (Biorad, Biobeads S-X1). הטור היה eluted עם THF טהור, הלהקה כהה נע עם חזית נאסף.

2.16) THF הוסר על המאייד סיבובית, ואת החומר הנותר היה מיובש בחלל ריק.

3. בדיקה ואפיון

אפיון Photophysical כולל מדידות של ספקטרום של בדיקה קליטה ופליטה, זרחני חיים τ 0 ושטרן-Volmer חמצן מרווה קבועים k q בתנאים פיזיולוגיים.

3.1) ספקטרום הקליטה והפליטה מתקבלים בתנאים הסביבה באמצעות מכשור סטנדרטי (ספקטרופוטומטר ו fluorometer יציב). ~ 1 פתרונות מיקרומטר של החללית נמצא בשימוש.

3.2) הבא, העלילה שטרן Volmer כיול מתקבל. זוהי המדידה החשוב ביותר, משום שהיא מאפשרת לנו להתייחס לכל החיים של החללית לריכוז חמצן.

3.3) פתרון של החללית ב PBS חיץ (pH 7.2) ממוקם קובט גלילי מיוחד, אשר ממוקם בתוך תא טמפרטורה מבוקרת, הנמצא בתוך כלוב אור בלתי חדיר עם יציאות סיבים אופטיים עירור ופליטה. הסיבים מובאים במגע קרוב עם קובט בתוך החדר בגיאומטריה ימנית זווית.

3.4) קובט סגור עם פקק, שלתוכו בעל רגישות גבוהה קלארק סוג אלקטרודה החמצן (חמצן CK-אלקטרודה) מוכנס. הפקק מכילה גם שתי יציאות מחט עבור מפרצון ו לשקע של ארגון. אלקטרודה הוא שקוע בפתרון, בעוד המחטים רק לספק זרימה של זרם הגז מעל פני השטח את הפתרון. בתחילה, ארגון לא מחובר כניסה.

3.5) הטמפרטורה מוגדר הערך הרצוי (בדרך כלל 36-37 מעלות צלזיוס) ואת הפתרון נותר תחת ערבוב איזון.

3.6) סיבים עירור מחובר ליציאת עירור של phosphorometer דיגיטלית, המופעלת על ידי מחשב. מקור האור phosphorometer היא הספק גבוה LED, אשר נשלטת על ידי פלט 333 kHz D / A הלוח. סיבים הפליטה מחובר ליציאת אחר אופטי של phosphorometer, אשר מצמידים את APD מאוד אינפרא אדום רגיש (מפולת photodiode). הפלט של דיודה מוגבר ומוכנס לתוך התעלה / D של לוח הבקרה זהה, המאפשר סנכרון בין עירור ערוצי הפליטה.

3.7) השליטה תוכנה אלדור שפל של פולסים עירור בכל אורך רצוי (למשל 5 או 10 מילישניות), ואחריה אוסף של ריקבון זרחני בתקופה כל נבחר שרירותית (בדרך כלל 2-3 ms). הזמן הנדרש למדידת חיים יחיד הוא בדרך כלל 0.5-1, לעומת זאת, מדידות ניתן להשיג מהר ככל 10-20 לשנייה.

3.8) הפלט של אלקטרודת חמצן מוגבר וביים לתוך אחר הלוח / D על אותו המחשב. זהו לוח תדר נמוך (1 מקסימום kHz), אשר משמש כדי להקליט את האלקטרודה הנוכחית בתקופות הזמן שנבחר. תוכנית להקלטה נתוני האלקטרודה פועלת בו זמנית עם התוכנה phosphorometer.

3.9) כאשר הטמפרטורה היא פתרון equilibrated, הן phosphorometer ואת התוכניות אלקטרודה הם מאותחל באותו זמן לבצע מדידות בכל 10 s. התפוקות שלהם מחוברים באופן סינכרוני לשני קבצים נפרדים. לאחר מכן, ארגון מחובר ליציאת היניקה על פקק קובט.

3.10) כאשר ארגון זורם על פני השטח של הפתרון זזה, זה מחליף בהדרגה חמצן. התוצאה היא ירידה של הזרם אלקטרודה ועלייה החיים זרחני, אשר נמדד על ידי phosphorometer. בדרך כלל, החמצן העקורים בצורה פתרון לחלוטין לאחר כ - 2 שעות, במהלכן הנתונים הם לגמרי מתנתק באופן אוטומטי לקבצים.

3.11) לאחר סיום הריצה טיטרציה, הנתונים האלקטרודה ואת תוחלת החיים זרחני מיובאים תוכנית הניתוח הסטנדרטי (מקור Miocrocal למשל). הנוכחית אלקטרודה תלוי באופן ליניארי על ריכוז חמצן, עבור האלקטרודה השתמשו בו הוא אפס כמעט בכל חמצן אפס. בלחץ אטמוספרי, ת.ד. 2 ידוע (על 150 מ"מ כספית). לפיכך, הנתונים אלקטרודה ניתן להמיר ישירות בהיקף חמצן, ואת העלילה של חייו זרחני הפוך לעומת ת.ד. 2 ניתן לבנות. עלילה זו מצויד בקו ישר בשיטת הריבועים הפחות לתת מרווה חמצן כ.ק. קבוע כמו מדרון שלה. החיים זרחני t0 מתקבל גם מן להתאים אותו (כמו ההופכי של יירוט) או ישירות דרך המדידה על חמצן אפס.

3.12) אם נדרש, טיטרציה חוזרת באמצעות פתרון של בדיקה בנוכחות אלבומין - חלבון הנמצאים הפלזמה בדם בריכוזים גבוהים, - כדי לחקות את התנאים נפגשו במערכת ניסיונית אמיתית (דם של חיה in vivo). להשיג שטרן Volmer המגרשים צריך להיות זהה אם dendrimer היא להגן על החללית גם קבוצות PEG לבודד את החללית מאנשי קשר עם אלבומין. אחרת, בדיקה החלבונים בדם יהיה אינטראקציה, וזה יוביל העלילה שטרן Volmer שינה, גרימת עמימות במדידות חמצן.

כיול קבועים מתקבל לפיכך משמשים בניסויים הדמיה שבה ריכוזי החמצן הם ידועים מראש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

תמיכה של מענקים EB007279 ו HL081273 מארה"ב NIH היא הודתה בהכרת תודה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-methylpyrrolidinone NMP
trifluoroacetic acid TFA
diisopropylethylamine DIPEA
2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate HBTU
dimethylsulfoxide DMSO
CDMT=1-chloro-3,5-dimethoxytriazine CDMT
NMM=N-methylmorfoline NMM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
  2. Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
  3. Lebedev, A. Y. Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems. Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).
  4. Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins. Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).
  5. Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions. Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).
  6. Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen. J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).

Tags

ביולוגיה של התא גיליון 37 חמצן זרחני porphyrin dendrimer הדמיה nanosensor שני הפוטונים
סינתזה כיול nanoprobes זרחני עבור הדמיה חמצן במערכות ביולוגיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sinks, L. E., Roussakis, E.,More

Sinks, L. E., Roussakis, E., Esipova, T. V., Vinogradov, S. A. Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems. J. Vis. Exp. (37), e1731, doi:10.3791/1731 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter