Summary
Vi presentiamo i principi delle misure di ossigeno da tempra fosforescenza e la progettazione commento su nanosensori dendritiche porfirina-based per l'imaging di ossigeno nei sistemi biologici.
Abstract
Misurazione dell'ossigeno da tempra fosforescenza [1, 2] è costituito dai seguenti passi: 1) la sonda viene consegnato nel mezzo di interesse (es. sangue o liquido interstiziale), 2) l'oggetto viene illuminato con luce di lunghezza d'onda appropriata al fine di eccitare la sonda nel suo stato di tripletto, 3) la fosforescenza emessa è raccolta, e suo sviluppo nel tempo viene analizzato per produrre la vita fosforescenza, che viene convertita in concentrazione di ossigeno (o pressione parziale, pO
Protocol
1. Descrizione generale del protocollo di misurazione dell'ossigeno
(Questa sezione non ha alcuna azione, ma è cruciale per capire il resto della carta. Può essere girato, ad esempio, come una sequenza di alcune diapositive in Power Point, accompagnato dalla voce).
1.1) La sonda viene consegnato nel mezzo di interesse, ad esempio, iniettata nel fluido interstiziale sangue o di un animale.
1.2) L'oggetto (superficie del tessuto), è illuminata con la luce di lunghezza d'onda appropriata al fine di promuovere la sonda nel suo stato di tripletto eccitato. Tipicamente l'eccitazione avviene attraverso il meccanismo di un fotone. Tuttavia, nel caso di speciale a due fotoni avanzata sonde, l'eccitazione può essere fatto tramite il meccanismo a due fotoni, che consente l'utilizzo delle sonde ad alta risoluzione applicazioni di microscopia. Un fotone di eccitazione generalmente fornisce risoluzione spaziale di meno, ma richiede una strumentazione più semplice e può essere utilizzato in un unico punto le misurazioni con LED a base di fibra ottica phosphorometers.
1.3) Fosforescenza emessa dalla sonda proviene dal longevo stato di tripletto. La molecola sonda deve essere appositamente progettato per fornire alta resa quantica dello stato di tripletto ed emettono fosforescenza invece di fluorescenza. Mentre in stato di tripletto, la sonda può sperimentare incontri collisione con le molecole di ossigeno, che può disattivare la stato di tripletto - ". Tempra", un processo chiamato In assenza di ossigeno, la durata della stato di tripletto, e quindi della decadenza fosforescenza, è τ 0. In presenza di ossigeno, la durata fosforescenza (τ) è ridotta a causa della tempra. C'è una relazione diretta tra la durata dello stato di tripletto e la quantità di ossigeno nell'ambiente. Questo è il famoso rapporto Stern-Volmer, che collega la durata (τ) della fosforescenza di concentrazione di ossigeno [O 2] (o pressione parziale di ossigeno pO 2):
Nei sistemi biologici, l'ossigeno è di gran lunga il più efficace quencher di fosforescenza, che rende il metodo di spegnimento fosforescenza molto selettiva per l'ossigeno.
1.4) Per misurare la t vita, i fotoni emessi fosforescenti sono cestinate nel tempo. Ad esempio, dopo l'impulso di eccitazione, 200 fotoni possono essere raccolte nei primi 15 microsecondi, 150 fotoni raccolti nei prossimi 15 microsecondi, e così via, fino a quando non fotoni vengono raccolti. I numeri nelle celle rilevate in tempo dare il decadimento fosforescenza, che viene analizzato per produrre la durata τ. Nella diagnostica per immagini, questa procedura è applicata in ogni singolo pixel dell'immagine, con conseguente mappe vita fosforescenza. Misure di vite sono insensibili alla eterogeneità della distribuzione della sonda durante l'oggetto, che è comune per i campioni biologici. Così, solo su vite rapporto ossigeno. Durata τ sono convertite in concentrazioni di ossigeno con il rapporto Stern-Volmer.
2. Costruzione di sonde fosforescenti
Sonde fosforescenti per misure di ossigeno nei sistemi biologici costituiti da cromofori fosforescente (nuclei), incapsulato in gabbie costruite con dendrimeri - hyperbranched polimeri altamente regolare [3]. Dendrimeri proteggere i nuclei dalle interazioni con l'ambiente e controllare la velocità di diffusione di ossigeno al core, permettendo di ottimizzare la sensibilità e la gamma dinamica delle sonde (costante k q nel rapporto Stern-Volmer). Il capolinea del dendrimeri sono modificati chimicamente inerte con polietilene glicole idrofile (PEG) i gruppi, rendendo le sonde altamente solubile in acqua ed evitare le loro interazioni con macromolecole biologiche.
Nuclei fosforescente delle sonde sono complessi Pt o Pd di porfirine e π-extended porfirine. π-Extended porfirine sono porfirine in cui si fondono anelli di pirrolo con frammenti aromatiche esterni. π-Extension permette la sintonizzazione delle sonde proprietà spettroscopiche per soddisfare le esigenze di una particolare applicazione di imaging (microscopia ad esempio contro la tomografia). Come esempio, si descrive la sintesi di tetaaryltetrabenzoporphyrins Pd (4 PdAr TBP) [4]. PdAr 4 TBP hanno bande di assorbimento potente nel lontano rosso parte della fosforescenza spettro e forte, adatto per le misure di ossigeno biologico.
La sintesi di PdAr 4 TBP è costituito dai seguenti passaggi:
2.1) Preparazione di tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) da Lindsey condensa [5] di tetrahydroisoindole con benzaldehydes sostituito. Ad una soluzione 0,01 M di tetrahydroisoindole (1 eq) in CH <sub> 2 CL 2 l'aldeide aromatica (1 eq) è stato aggiunto sotto argon. La miscela di reazione è stata agitata per 10 minuti al buio a temperatura ambiente BF 3 Xet 2 O (0,2 eq) è stato aggiunto, e la miscela di reazione è stata agitata a temperatura ambiente per altre 2 h. DDQ (1 eq) è stato aggiunto, e la miscela è stata lasciata tutta la notte sotto agitazione continua. La soluzione è stata lavata con il 10% aq Na 2 SO 3, 10% aq Na 2 CO 3, 5% aq HCl e infine con acqua salata. La fase organica è seccato su Na 2 SO 4, quindi concentrato nel vuoto. Il residuo è stato ricristallizzato da CH 2 Cl 2 - ter-butil etere miscela per dare 4 TCHP come polvere verde Ar. Le rese sono circa il 50%.
2.2) Inserimento del Pd per ottenere PdAr 4 TCHPs. Free-base di porfirine (1 eq) sono stati trattati con 2 o pDC Pd (OAC) 2 (1.2 eq) in refluenti CH 3 CN, in presenza di un eccesso di Et 3 N (20 eq). La conversione è stata monitorata dalla spettroscopia UV-vis (solvente CH 2 Cl 2-AcOH) e considerata completa dopo la banda di Soret dettatura a 468-472 nm scomparso. La miscela è stato permesso di raffreddare, diluito con CH 2 Cl 2 e filtrato attraverso un sottile strato di Celite per rimuovere Pd (0). Il solvente è stato evaporato e il residuo è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando CH 2 Cl 2 come solvente. Frazione rosso scuro sono stati raccolti, il solvente è stato evaporato per dare obiettivo PdAr 4 TCHPs della resa quasi quantitativi.
2.3) PdAr 4 TBP sono stati preparati da ossidazione del PdAr 4 TCHPs con le 2 volte l'eccesso di DDQ (16 eq) in THF riflusso. Durante il riflusso, il colore cambiato da rosso scuro al verde scuro. Il solvente è stato evaporato, il residuo è stato diluito con CH 2 Cl 2, lavati con il 10% aq Na 2 SO 3, acqua e salamoia. La fase organica è seccato su Na 2 SO 4 e concentrato nel vuoto. Il residuo è stato purificato mediante cromatografia su gel di silice (eluente CH 2 Cl 2). La prima frazione verde scuro è stato raccolto, concentrato nel vuoto per dare 85-90% di polvere di colore blu-verde PdAr4TBP è.
2.4) gruppi estere periferiche di tetrachis Pd-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) sono stati idrolizzati con 10 volte l'eccesso di KOH in 1% (v / v) acqua / THF a rt. Il solvente è stato decantato dal precipitato di sali di potassio formato di derivati dell'acido carbossilico di PdAr4TBP è. I solidi sono stati sciolti in acqua, mescolato per ulteriori 2 ore, acidificato con conc. HCl a pH ~ 4-5. Il precipitato ottenuto è stato isolato per centrifugazione, lavate con acqua ed essiccato nel vuoto.
Proteggere dendroni. Ogni singolo ramo del dendrimero si chiama dendron. Dendroni proteggere sono costruiti con aril-glicina (AG) blocchi costruttivi. Dendroni AG possono essere facilmente sintetizzati da economico materie prime e isolati in purezza ed elevate rese mediante cromatografia senza metodi. Sintesi di generazione 2 (G2) AG-dendron è costituito dai seguenti passaggi:
2.4) Sintesi degli elementi costitutivi, Boc-protetta 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide e 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide, utilizzando il metodo Fischer haloacyl alogenuri.
2.5) Accoppiamento degli elementi costitutivi utilizzando CDMT / NMM chimica accoppiamento peptide.
2.6) rimozione della protezione del gruppo amminico focale agitando la soluzione del dendron G2 in TFA per 2 ore a RT
2.7) Per il montaggio del dendroni generazione superiore, aggancio / deprotezione passi sono ripetuti.
Dendrimero gruppo si ottiene accoppiamento del dendroni deprotetto a PdAr4TBP (o porfirina altro) utilizzando la HBTU / DIPEA chimica accoppiamento.
2.8) In primo luogo, il Boc-gruppi di protezione vengono rimossi dal dendron. Per esempio, Boc-protetta dendron G3 (0,58 g) è stato sciolto in TFA (15 ml), e la miscela è stata lasciata reagire a temperatura ambiente per 2 ore. L'acido è stato rimosso per evaporazione rotante, ottenendo il dendron come il TFA-sale. Il residuo è stato dissolto in secca NMP (10 ml) e qualche goccia di DIPEA sono stati aggiunti, per placare le tracce di TFA.
2.9) Prima di iniziare la reazione di accoppiamento, è fondamentale per sciogliere completamente la porfirina. Per esempio, Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0,061 g) è stato sciolto in secca NMP (65 ml) sotto il riscaldamento a 140 ° C per 10 minuti, sotto flusso di azoto.
2.10) La soluzione è stata raffreddata a temperatura ambiente, HBTU (0,211 g) è stato aggiunto, e la miscela è stata agitata per 5 min.
2.11) DIPEA (0,35 ml) è stato aggiunto alla miscela in una porzione, immediatamente seguita dalla aggiunta del SOLUZIOsu di TFA-sale della dendron in NMP (vedi 2.8), e la miscela è stata lasciata una notte sotto agitazione.
2.12) La miscela è stata versata in 3% aq. NaCl (350 ml), e il precipitato risultante è stato raccolto per centrifugazione e lavato con acqua, MeOH, e Et 2 O da sospensione ripetitivi / centrifugazione cedere il bersaglio porfirina-dendrimero.
2.13) Per idrolizzano i gruppi esteri periferici, il dendrimero è stato trattato con NME 4 OH (~ 5 mm) in DMSO / MeOH nel periodo 20-60 min, seguito dalla rimozione completa solvente. Questa procedura ci ha permesso di generare dendrimeri con sufficiente numero di gruppi carbossilato per dare solubilità in acqua. Per completare l'idrolisi, la dendrimero è stato trattato con NaOH 0.1N acquosa (una notte). Di conseguenza, puro porfirina-dendrimero acidi carbossilici possono essere isolati in 80-95% dei rendimenti.
Modifica della periferia dendrimero. A questo punto, a partire dalla stessa porfirina-dendrimero, sia di uno o due fotoni sonde possono essere sintetizzati. Nel primo caso, tutti i gruppi periferici carbossilici sono modificate con le unità PEG - una metodologia nota come PEGilazione. In quest'ultimo caso, diversi gruppi carbossilici sono prima accoppiato con due fotoni cromofori antenna (cumarina-343) modificato con etilendiammina (EDA) linker, seguita da PEGilazione del carboxyls rimanenti [6]. Dendrimeri sono stati pegilato con monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av.. MW 1000) utilizzando HBTU / DIPEA chimica accoppiamento.
2.14) Per una soluzione del dendron in NMP (o DMF) (1-10 mM) eccesso di 1,25 volte di HBTU è stato aggiunto, e la miscela di reazione è stata agitata a temperatura ambiente per 10 minuti. Eccesso di 6,25 volte di DIPEA è stato aggiunto, seguito con l'aggiunta immediata di un eccesso di 1,25 volte di m-PEG-NH2. La miscela di reazione è stata agitata per 2 giorni a temperatura ambiente. Etere etilico è stato aggiunto alla miscela di reazione, il precipitato formato è stato separato per centrifugazione e ri-precipitato da THF con l'aggiunta di etere etilico.
2.15) purificazione finale è stato ottenuto con dimensioni-cromatografia esclusione dalla raccolta della fase di primo fronte. Pegilato porfirina-dendrimero è stato dissolto in una piccola quantità di THF (~ 15 ml) e caricato sulla sommità di una colonna cromatografica riempito di polistirolo SEC fase (Biorad, Biobeads S-X1). La colonna è stata eluita con puro THF, e la banda di colore scuro in movimento con la parte anteriore è stato raccolto.
2.16) THF è stato rimosso su un evaporatore rotante, e il restante materiale è stato essiccato a vuoto.
3. Sonda caratterizzazione
Caratterizzazione fotofisiche comprende misurazioni di spettri di assorbimento e di emissione della sonda, fosforescenza durata τ 0 e Stern-Volmer ossigeno tempra costanti k q in condizioni fisiologiche.
3.1) Gli spettri di assorbimento e di emissione sono ottenuti in condizioni ambientali utilizzando strumenti standard (spettrofotometro e fluorimetro costante). ~ 1 microM soluzioni della sonda viene utilizzato.
3.2) Successivamente, il Stern-Volmer diagramma di taratura si ottiene. Questa è la misura più importante, perché ci permette di mettere in relazione la durata della sonda per la concentrazione di ossigeno.
3.3) Una soluzione della sonda nel tampone PBS (pH 7,2) si trova in una cuvetta speciale forma cilindrica, che viene posizionato all'interno della camera a temperatura controllata, che si trova all'interno di un leggero impermeabile gabbia con le porte per le fibre di eccitazione e di emissione ottica. Le fibre sono messi a stretto contatto con la cuvetta all'interno della camera in angolo retto geometria.
3.4) La cuvetta è chiuso con un tappo, in cui una molto sensibile Clark-elettrodo ossigeno (CK-elettrodo ossigeno) viene inserito. Il tappo contiene anche due porte aghi per aspirazione e mandata di argon. L'elettrodo è immerso nella soluzione, mentre gli aghi solo prevedere il flusso di flusso di gas al di sopra della superficie soluzione. In un primo momento, l'argon non è collegato alla presa.
3.5) La temperatura è impostata al valore desiderato (in genere 36-37 ° C) e la soluzione viene lasciata sotto agitazione per il raggiungimento dell'equilibrio.
3.6) La fibra di eccitazione è collegato alla porta eccitazione di un phosphorometer digitale, gestito da un PC. La sorgente di luce nel phosphorometer è un LED ad alta potenza, la cui uscita è controllato da un kHz D 333 / A a bordo. La fibra di emissione è collegata a un'altra porta ottica del phosphorometer, che è accoppiato ad un APD altamente sensibili all'infrarosso (valanga fotodiodo). L'uscita del diodo è amplificato e alimentato in A / canale D del consiglio stesso controllo, che permette la sincronizzazione tra l'eccitazione e canali di emissione.
3.7) Il software di controllo algenerazione di impulsi di eccitazione bassi di qualsiasi lunghezza desiderata (ad esempio 5 o 10 ms), seguita dalla raccolta di decadimento fosforescenza durante un qualsiasi periodo di arbitraria scelta (in genere 2-3 ms). Tempo necessario per una misura singola vita è tipicamente 0,5-1 s, tuttavia, le misurazioni possono essere ottenuti più rapidamente 10-20 al secondo.
3.8) L'uscita del elettrodo ossigeno viene amplificato e diretto in un altro A / D a bordo sullo stesso PC. Questa è una scheda a bassa frequenza (1 kHz max), che viene utilizzato per registrare l'elettrodo corrente in periodi di tempo selezionato. Il programma per la registrazione dei dati elettrodo funziona contemporaneamente con il software phosphorometer.
3.9) Una volta che la temperatura della soluzione è equilibrato, sia la phosphorometer ei programmi elettrodi vengono inizializzati allo stesso tempo di effettuare le misurazioni ogni 10 s. Le loro uscite sono registrati in modo sincrono in due file separati. Dopo di che, l'argon è collegato alla porta di ingresso sul tappo cuvetta.
3.10) Come argon scorre sulla superficie della soluzione agitata, sostituisce a poco a poco ossigeno. Ciò si traduce in una diminuzione della corrente elettrodo e un aumento della vita fosforescenza, che è misurata dal phosphorometer. Di solito, l'ossigeno è spostata la soluzione di tutto dopo circa 2 ore, durante i quali i dati sono registrati in modo completamente automatico in file.
3.11) Dopo la fine della corsa titolazione, i dati elettrodo e le durate fosforescenza sono importati in un programma di analisi standard (ad esempio Origine Miocrocal). L'attuale elettrodo dipende linearmente concentrazione di ossigeno, e per l'elettrodo utilizzato è praticamente zero a ossigeno zero. A pressione atmosferica, pO 2 è noto (circa 150 mm Hg). Così, i dati elettrodi possono essere direttamente convertiti alla scala di ossigeno, e la trama della vita inversa fosforescenza vs pO 2 può essere costruito. Questo grafico è dotato di una linea retta con il metodo dei minimi quadrati per dare il KQ tempra costante di ossigeno come la sua pendenza. Vita fosforescenza t0 è ottenuta dal fit stesso (come l'inverso del intercetta) o direttamente dalla misurazione a zero ossigeno.
3.12) Se necessario, la titolazione è ripetuta utilizzando una soluzione della sonda in presenza di albumina - una proteina presente nel plasma sanguigno in alte concentrazioni, - al fine di emulare le condizioni incontrato nel sistema reale sperimentale (sangue di un animale in vivo). La ottenere Stern-Volmer trame dovrebbero essere identici se il dendrimero protegge la sonda bene e gruppi PEG isolare la sonda dai contatti con l'albumina. In caso contrario, la sonda e le proteine nel sangue interagisce, e che porterà ad un alterato Stern-Volmer complotto, causando ambiguità nelle misure di ossigeno.
Costanti di calibrazione così ottenuti sono usati in esperimenti di imaging in cui le concentrazioni di ossigeno sono una sconosciuta a priori.
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Acknowledgments
Sostegno delle sovvenzioni EB007279 e HL081273 dagli Stati Uniti NIH Si ringrazia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-methylpyrrolidinone | NMP | ||
| trifluoroacetic acid | TFA | ||
| diisopropylethylamine | DIPEA | ||
| 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate | HBTU | ||
| dimethylsulfoxide | DMSO | ||
| CDMT=1-chloro-3,5-dimethoxytriazine | CDMT | ||
| NMM=N-methylmorfoline | NMM |
References
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