Summary
우리는 인광 담금질 및 생물 학적 시스템에서 산소 이미징을위한 포르피린 기반 돌기 nanosensors의 검토 설계에 의해 산소 측정의 원칙을 제시.
Abstract
인광 담금질 [1, 2]에 의해 산소 측정은 다음과 같이 구성되어 있습니다 : 1) 프로브가 관심의 미디어 (예 : 혈액 또는 침입형 액체)로 전달됩니다 2) 개체는 순서에 해당하는 파장의 빛으로 조명됩니다 자극 의 트리 플렛 상태로 촬영, 3) 배출 인광는 수집하며, 시간 과정은 산소 농도 (또는 부분 압력, PO로 변환되는 인광 수명을 항복으로 분석됩니다
Protocol
1. 산소 측정 프로토콜의 일반적인 설명
(이 섹션은 모든 작업을했지만 논문의 나머지 부분을 이해하는데 매우 중요합니다하지 않습니다. 이것이 음성과 함께, 몇 파워 포인트 슬라이드의 순서로, 예를 들어, 촬영하실 수 있습니다.)
1.1)이 프로브는 관심의 매체로 전달됩니다 예를 들어, 동물의 혈액이나 중간 유체 주입.
1.2) 개체 (조직의 표면은)는 흥분 플렛 상태로 탐사를 추진하기 위해 적절한 파장의 빛을 함께 조명됩니다. 일반적으로 여기는 한 광자 메커니즘을 통해 발생합니다. 그러나, 특별한 두 광자 향상된 프로브의 경우, 여기는 고해상도 현미경 응용 프로그램의 프로브를 사용하여 허용 두 광자 메커니즘을 통해 수행할 수 있습니다. 한 광자의 여진은 일반적으로 더 적은 공간 해상도를 제공하지만 간단한 장비가 필요하며 LED 기반 광섬유 phosphorometers 단일 포인트 측정에 사용할 수 있습니다.
프로브에 의해 방출 1.3) 인광은 긴 플렛 상태에서 유래. 프로브 분자는 특별히 플렛 상태의 높은 양자 수율을 제공하고 대신 형광 인광 방출하도록 설계되어야합니다. 플렛 상태에있는 동안 탐사선은 플렛 상태를 드 활성화할 수의 산소 분자와 collisional 조우를 경험할 수 있습니다 - ". 담금질 '이라는 과정 인광 부패 따라서 산소, 플렛 상태의 수명, 그리고이없는 경우, τ 0입니다. 산소의 존재에 인광 수명은 (τ) 담금질의 결과로 단축됩니다. 플렛 상태의 수명과 환경에서 산소의 양 사이 직접적인 관계가있다. 이것은 산소 농도 [O 2] (또는 산소 분압 PO 2) 인광의 수명을 (τ) 연결하는 잘 알려진 스턴 볼머 관계이다 :
생물 학적 시스템에서 산소가 지금까지 산소로 인광 담금질 방법은 매우 선택적하게 인광의 가장 효과적인 끄는 것입니다.
1.4) 수명 t를 측정하기 위해서는 배출 인광을 발하는 광자는 시간에 binned 있습니다. 어떤 광자가 수집되지 때까지 예를 들어, 여기 펄스 후에 200 광자는 등등, 처음 15 마이크로초에서 다음 15 마이크로초에서 수집한 150 광자를 수집하고 수 있습니다. 방식의 숫자는 수명 τ를 반환하기 위해 분석되는 인광 부패를주는 시간이 역모를 꾸몄다. 영상에서는,이 절차는 인광 평생지도에서 결과 이미지의 모든 픽셀에 적용됩니다. 수명의 측정은 생물 학적 샘플에 대한 일반되는 개체에 걸쳐 프로브 배포판의 heterogeneities로 구분하지 않습니다. 따라서, 인생은 산소에 대한 리포트입니다. 수명 τ는 스턴 볼머 관계를 사용하여 산소 농도로 변환됩니다.
2. 인광을 발하는 프로브 구축
생물 학적 시스템의 산소 측정 프로브는 인광을 발하는 dendrimers의 구축 새장에 캡슐 인광을 발하는 chromophores (코어)로 구성 - 매우 일반 hyperbranched 폴리머 [3]. Dendrimers은 환경과 상호 작용에서 코어를 보호하고 가능한 프로브의 감도 및 동적 범위 (스턴 볼머 관계 상수 K Q)를 최적화하고, 코어 산소 확산의 속도를 제어합니다. dendrimers의 테르 미니 (Termini)는 프로브가 높은 수용성 및 생물 학적 macromolecules와의 상호 작용을 방지하고, 화학적으로 불활성 친수성 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 그룹으로 변경됩니다.
프로브의 인광을 발하는 코어 porphyrins과 π - 확장 porphyrins의 PT이나 경찰들이 단지입니다. π - 확장 porphyrins은 피롤 고리가 외부 아로마 조각과 융합하는 porphyrins 있습니다. π - 연장 프로브 spectroscopic 속성의 튜닝은 특정 이미징 응용 프로그램 (예 : 현미경 대 tomography)의 요건을 충족하실 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 경찰들이의 tetaaryltetrabenzoporphyrins의 합성 (PdAr 4 TBP) [4]. 대해 설명합니다 PdAr 4 TBP가 스펙트럼과 강한 인광의 멀리 붉은 부분에 강력한 흡수 밴드를 잘 생물 학적 산소 측정에 적합합니다.
PdAr 4 TBP의 합성은 다음과 같이 구성되어 있습니다 :
린지 결로에 의해 tetraaryltetracyclohexenoporphyrins 2.1) 준비 (Ar4TCHP) [5] 대체 benzaldehydes과 tetrahydroisoindole니다. CH에서 tetrahydroisoindole (1 EQ)의 0.01 M 솔루션 <서브> 2 CL 2 아로마의 알데히드 (1 EQ)는 아르곤 아래에 추가되었습니다. 반응 혼합물은 RT BF 3 xEt 2 O (0.2 EQ)의 어둠 10 분 흔들되었고 추가되었고, 반응 혼합물은 추가 2 H. 위해 알티에 흔들되었습니다 DDQ (1 EQ) 추가되었고, 혼합물은 지속적인 교반에 따라 하루 남았는데. 솔루션 10% AQ 나 2 SO 졌죠 세 10 % AQ 나 2 CO 3, 5% AQ HCL 그리고 마지막으로 소금물로. 유기 단계는 다음 진공 상태에서 농축, 나 2 SO 4 이상의 건조되었다. tert - 부틸 에테르 혼합물 아르에게 녹색 분말로 4 TCHP를 제공 - 잔류물은 CH 2 Club 호텔 2 recrystallized되었습니다. 수확량은 약 50 %입니다.
경찰들이 2.2) 삽입 PdAr 4 TCHPs를 얻을 수 있습니다. 자유 기지 porphyrins (1 EQ) 잇 3 N (20 EQ)의 초과의 존재에 CH 3 CN을 refluxing에 PdCl 2 경찰들이 (OAc) 2 (1.2 EQ)와 치료를했다. 변환은 UV - 마주 분광에 의해 감시 (용매 CH 2 Club 호텔 2 AcOH) 및 468-472 nm의에서 받아쓰기의 Soret 밴드 완료 후 사라진 것으로 간주되었다. 혼합물은 CH 2 Club 호텔 2 희석과 경찰들이 (0) 제거 Celite의 얇은 레이어를 통해 필터링, 진정 허락되었습니다. 솔벤트가 증발했다, 그리고 잔류물은 용제로 Club 호텔 2 채널 2를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마 토그래피에 의해 정화되었다. 다크 레드 분수가 수집되었다, 용매는 대상에게 거의 양적 수율에 PdAr 4 TCHPs를 제공 증발했다.
2.3) PdAr 4 TBP의는 refluxed THF에 DDQ의 2 배 초과 (16 EQ)와 PdAr 4 TCHPs의 산화에 의해 준비되었다. refluxing 동안 색깔은 짙은 붉은 색의 깊은 녹색으로 변경. 솔벤트가 증발했다, 찌꺼기는 10% AQ 나 2 SO 3, 물, 소금물로 씻어, CH 2 Club 호텔 2 희석되었다. 유기 단계가 나 2 SO 4 이상의 건조와 진공에 집중되었다. 잔류물은 실리카 겔에서 크로마 토그래피 (eluent CH 2 Club 호텔 2)에 의해 정화되었다. 첫 번째 어두운 녹색 분수는 PdAr4TBP의 등 푸른 녹색 분말 85-90%를 제공하기 위해 진공 상태에서 농축, 수집했습니다.
경찰들이 중 2.4) 주변 에스테르 그룹 tetrakis - (3,5 - dibutoxycarbonylphenyl) tetrabenzoporphyrin은 (PdAr4TBP) 1 % (V / V) 물 / 알티에서 THF에 코의 10 배 초과를 사용하여 분해되었다. 용매는 PdAr4TBP의 카르복실산 유도체의 형성 칼륨 염의 침전물에서 decanted했다. 고체는 물속에 녹아 있었다 CONC와 산성 추가 2 H에 대한 냈다. 산도 ~ 4-5로 HCL. 얻은 침전물을 물로 씻어하고 진공 건조, 원심 분리에 의해 고립되었다.
dendrons를 보호하는 것은. dendrimer의 각 개별 분기 덴드론라고합니다. 보호 dendrons는 아릴 - 글리신 (AG) 빌딩 블록으로부터 구성되어 있습니다. AG의 dendrons 쉽게 저렴하게 시작 소재의 합성 및 크로마 토그래피없는 방법으로 고순도 및 수율에 격리 수 있습니다. 세대 2 (G2) AG - 덴드론의 합성은 다음과 같이 구성되어 있습니다 :
피셔 haloacyl 할로겐 방법을 사용하여 빌딩 블록 2.4) 합성, BOC 보호 3,5 - dicarboxyphenyl glycineamide와 3,5 - dibutoxycarbonylphenyl glycineamide.
2.5) CDMT / NMM 펩타이드 결합 화학을 사용하는 빌딩 블록의 커플링.
2.6) RT 2 H에 대한 TFA에 G2 덴드론의 솔루션을 교반하여 초점 아미노 그룹을 Deprotecting
높은 세대 dendrons의 조립 2.7)는 커플링 / deprotection 단계를 반복합니다.
Dendrimer 조립은 HBTU / DIPEA 커플링 화학을 사용하여 PdAr4TBP (또는 다른 포르피린)에 deprotected dendrons의 결합에 의해 이루어진다.
2.8)는 첫째, BOC - 보호 그룹이 덴드론에서 제거됩니다. 예를 들어, BOC 보호 G3의 덴드론 (0.58 g)을 TFA (15 ML)에 해산되었고, 혼합물은 2 시간에 대한 RT 반응에서 왼쪽으로했다. 산성은 TFA - 소금으로 덴드론을 항복, 로타리 증발에 의해 제거되었습니다. 잔류물은 건조 NMP (10 ML)에 해산되었으며 DIPEA 몇 방울 TFA의 흔적을 담금질하기 위해 추가되었습니다.
2.9)은 커플링 반응을 시작하기 전에, 그것은 완전히 포르피린를 해산하는 것이 중요합니다. 예를 들어, PT tetracarboxyphenylporphyrin (0.061 g)가 140 이하 가열 건조 NMP (65 ML)에서 해산되었다 ° 질소의 흐름에 따라 10 분에 대한 C.
2.10)이 솔루션은 실내 온도로 냉각되었다, HBTU는 (0.211 g) 추가되었고, 혼합물은 5 분 흔들했다.
2.11) DIPEA (0.35 ML)은 즉시 soluti의 또한 다음, 한 부분의 혼합물에 추가되었습니다NMP에 덴드론 (2.8 참조)의 TFA - 소금과 혼합물에 대한 감동에 따라 하루 남았는데.
2.12)이 혼합물은 3% AQ에 부어되었습니다. NaCl (350 ML) 및 결과 침전물은 원심 분리 수집하여 반복 정지 / 대상 포르피린 - dendrimer를 얻을 수하기 위해 원심 분리에 의해 물, MeOH, 및 ET 2 O로 세탁했다.
주변 에스테르 그룹을 hydrolyze하기 위해 2.13) dendrimer 먼저 전체 용매 제거하여 다음 20-60 분 동안 DMSO / MeOH에 NMe 4 OH (~ 5 ㎜)와 치료를했다. 이 절차는 우리가 수성 용해도를 제공 카르복 그룹의 충분한 번호 dendrimers를 생성할 수있었습니다. 가수 분해를 완료하려면, dendrimer는 0.1N NaOH 수용액 (야간)로 취급합니다. 그 결과, 순수 포르피린 - dendrimer carboxylic 지방산은 80-95%의 수율에 격리 수 있습니다.
dendrimer의 주변의 수정.이 시점에서이 같은 포르피린 - dendrimer부터, 중 하나 또는 두 개의 광자 프로브는 합성 수 있습니다. 첫 번째 경우에는, 모든 주변 카르 복실 그룹 PEG 단위 수정 - PEGylation으로 알려진 방법을. 후자의 경우에는 몇 가지 카르 복실 그룹은 처음 두 - 광자 안테나 chromophores (Coumarin - 343) 나머지 carboxyls의 PEGylation 다음, 에틸렌 (EDA) linkers와 수정 [6].과 함께 아르 Dendrimers는 HBTU / DIPEA 커플링 화학을 사용하여 monomethoxyoligoethyleneglycolamine을 (M - PEG - NH 2, AV. MW 1000)를 사용 PEGylated되었습니다.
NMP에 덴드론 (또는 DMF) (10-10 ㎜) HBTU의 1.25 배 초과의 솔루션 2.14)가 추가되었고, 반응 혼합물은 10 분 RT에서 흔들했다. DIPEA의 6.25 배 초과는 M - PEG - NH2의 1.25 배 초과의 즉각 또한 다음, 추가되었습니다. 반응 혼합물은 알티 2 일 흔들했다. 디에틸 에테르이 반응 혼합물에 추가 되었음 형성된 침전물은 디에틸 에테르 이외의 THF에서 원심 분리하고 다시 시켰던으로 구분되었다.
2.15) 최종 정화는 최초의 앞 단계의 수집에 의해 크기 배제 크로마 토그래피와 함께 달성했습니다. PEGylated 포르피린 - dendrimer은 THF (~ 15 ML)의 소량의 용해와 폴리스티렌 SEC 단계 (Biorad, Biobeads S - X1)로 가득 색층 칼럼의 위에 적재되었다. 열은 순수한 THF와 eluted되었고, 전면과 함께 이동 어두운 컬러 밴드가 수집되었다.
2.16) THF는 로터리 증발기에서 제거되었고, 나머지 재료는 진공 상태에서 건조되었다.
3. 프로브 특성화
Photophysical 특성은 프로브의 흡수 및 방출 스펙트럼, 인광 수명 τ 0 스턴 볼머 산소 칭 상수 K Q 이하 생리적 조건의 측정을 포함하고 있습니다.
3.1) 흡수 및 방출 스펙트럼은 표준 장비를 (분광 광도계 및 꾸준한 fluorometer)을 사용하여 주위 조건 하에서 얻을 수 있습니다. 프로브의 ~ 1 μm의 솔루션이 사용됩니다.
3.2) 다음, 스턴 볼머 보정 음모가 얻어진다. 그것이 우리가 산소 농도에 대한 프로브의 수명을 연관 수 있기 때문에 이것은 가장 중요한 측정이다.
3.3)는 PBS 버퍼 (산도 7.2)에 탐침의 솔루션은 여기와 발광 광섬유에 대한 포트 라이트 스며들지 케이지 내부에있는 온도 제어 챔버 내부에 위치하는 특수 원통형 쿠베트,에 배치됩니다. 섬유는 오른쪽 각도 기하학의 챔버 내부의 쿠베트 들과의 긴밀한 접촉으로 이동됩니다.
3.4) 쿠베트가있는에 매우 민감한 클라크 형 산소 전극 (CK - 산소 전극)가 삽입, 스토퍼로 닫힙니다. 스토퍼는 또한 입구와 아르곤의 콘센트에 두 바늘 포트가 포함되어 있습니다. 바늘은 단순히 솔루션 표면 위에 가스 유동의 흐름을 제공 반면 전극은 용액에 포장되어 있습니다. 처음에는 아르곤은 입구에 연결되지 않습니다.
3.5)은 온도가 원하는 값 (일반적으로 36-37 ° C)로 설정하고 솔루션은 평균에 대한 교반하에 남아 있습니다.
3.6) 여기 섬유는 PC에서 운영하는 디지털 phosphorometer의 여기 포트에 연결되어 있습니다. phosphorometer의 광원은 누구 출력 333 kHz에서 D / A 보드에 의해 제어되는 고출력 LED입니다. 방출 섬유는 높은 적외선에 민감한 APD (애벌 photodiode)에 결합되는 phosphorometer, 다른 광학 포트에 연결되어 있습니다. 다이오드의 출력은 증폭되고 여기 및 방출 채널 사이의 동기화를 허용하는 동일한 제어 보드의 A / D 채널로 공급됩니다.
3.7) 제어 소프트웨어를 알어떤 임의의 선택 기간 (일반적으로 2-3 MS) 동안 인광 부패를 수집하여 다음에 원하는 길이 (예 : 5 또는 10 MS)의 여기 펄스의 로우스 생성. 한 평생 측정에 필요한 시간은 일반적으로 0.5-1 S는하지만, 성능은 10-20로 초당으로 신속하게 얻을 수 있습니다.
3.8) 산소 전극의 출력은 동일한 PC에있는 다른 A / D 보드로 증폭하고 감독합니다. 이것은 선택 기간에 전류 전극을 기록하는 데 사용되는 저주파 보드 (1 kHz에서 최대)입니다. 전극 데이터를 녹음 프로그램은 phosphorometer 소프트웨어와 동시에 실행됩니다.
솔루션 온도가 equilibrated되면 3.9)는 phosphorometer 및 전극 프로그램을 모두 측정에게 매 10 S.를 수행하는 동시에 초기 그들의 출력은 두 개의 별도 파일에 동기 기록됩니다. 그 후, 아르곤은 쿠베트 스토퍼의 입구 포트에 연결되어 있습니다.
아르곤으로 3.10)가 흔들 솔루션의 표면 위로 흐르는, 그것은 점차적으로 산소를 대체합니다. 전극 전류의 감소와 phosphorometer에 의해 측정되는 인광 수명에 증가이 결과를. 보통 산소는 데이터가 완전히 자동으로 파일에 기록되는 시간 동안, 전적으로 약 2 H 후 양식에게 솔루션을 뺀 것입니다.
3.11) 적정 실행의 종료 후, 전극 데이터와 인광 수명은 표준 분석 프로그램 (예 : Miocrocal 유래)로 가져올 수 있습니다. 전극 전류는 산소 농도에 선형적으로 의존하고, 전극에 사용은 제로 산소에 거의 제로입니다. 대기압에서 PO 2 (150mm HG에 대해) 잘 알려져 있습니다. 따라서 전극 데이터는 직접 산소 규모로 변환될 수 있으며, PO 2 대 역 인광 일생 일대의 줄거리는 건설 수 있습니다. 이 음모는 그 기울기로 산소 칭 상수 kq를 제공하기 위해 최소 제곱 방법을 사용하여 직선과 함께 장착되어있다. 인광 수명 t0는 중 동일한 맞게 (도청의 반전 등) 또는 직접 제로 산소의 측정에서 얻은 것입니다.
높은 농도의 혈장에 존재 단백질 -을 - 필요한 경우, 적정이 알부민의 존재에있는 프로브의 솔루션을 사용하여 반복 3.12) 조건을 에뮬레이션하기 위해서는 (동물의 피를 실제 실험 시스템에 만난 생체내에서). dendrimer 잘 프로브를 보호하고 PEG 그룹은 알부민과 연락처에서 프로브를 분리하면 얻을 스턴 볼머 플롯은 모두 동일해야합니다. 그렇지 않으면, 프로브 및 혈액에있는 단백질이 상호 작용하는 것이며, 그것은 산소 측정의 모호성을 초래 변경 스턴 볼머 계획으로 이어질 것입니다.
따라서 얻은 보정 상수는 산소 농도가 사전 알 수없는 경우 이미징 실험에 사용됩니다.
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Acknowledgments
NIH 미국에서 부여 EB007279 및 HL081273의 지원은 기꺼이 인정받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-methylpyrrolidinone | NMP | ||
| trifluoroacetic acid | TFA | ||
| diisopropylethylamine | DIPEA | ||
| 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate | HBTU | ||
| dimethylsulfoxide | DMSO | ||
| CDMT=1-chloro-3,5-dimethoxytriazine | CDMT | ||
| NMM=N-methylmorfoline | NMM |
References
- Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
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