Summary
نحن تقرير طريقة لإدخال وتعقب والتحليل الكمي التعبير GFP في الخلايا النباتية. هذه الطريقة تستخدم نظام التشغيل الالي للمصمم خصيصا لجمع صورة شبه مستمرة من أعداد كبيرة من العينات ، وعلى مر الزمن. نظهر أيضا استخدام ImageJ وImageReady لتحليل سلسلة الصور.
Abstract
عادة ما يتم دراسة التعبير الجيني في أنسجة النبات عن طريق الاستخلاص المدمرة للمركبات من الأنسجة النباتية ل
Protocol
المنهجية التالية الخطوط العريضة لبروتوكول لتحليل الصور في التعبير الجيني باستخدام جمع صورة النظام الآلي. لسهولة التفسير ، وكسر النهج العام إلى أربع خطوات : 1) إعداد البذور ، 2) إدخال الجينات باستخدام القصف الجسيمات ، 3) الروبوتية جمع الصور ، و 4) تحليل الصور. بالرغم من أنه يمكن استخدام هذه المنهجية العامة لمجموعة واسعة من التطبيقات الأخرى ، تستند مجموعات من البروتوكولات الحالية على استخدام الجينات الفلورية الخضراء (GFP) البروتين ، وهو الجين مراسل مفيدة لتتبع التعبير الجيني في نفس قطعة من الأنسجة الحية على مر الزمن.
أولا تحضير البذور
- يمكن شراؤها ليما الفول (Phaseolus الهلالي هندرسون السيرة الذاتية لبوش). البذور وحصاد أو مثالي من النباتات التي تزرع في غرفة النمو (50 ٪ الرطوبة النسبية ، 16 / 8 ح ضوء : الظلام ، 25/23 درجة مئوية يوم / ليلة). ويمكن الاحتفاظ في مرحلة ما بعد الحصاد جودة البذور بواسطة تخزين البذور في -20 درجة مئوية.
- إعداد أرجواني GA7 حاويات للبذور الإنبات. ورق الترشيح أضعاف أو المناشف الورقية لاحتوائه في الجزء السفلي من مربعات أرجواني. إضافة ~ 25 مل من الماء منزوع الأيونات على كل حاوية لتطريتها المناشف الورقية ، وسكب الماء قبالة الغير ممتص. مبلل الأوتوكلاف رقة تحتوي على خانات لمدة 20 دقيقة.
- 50 مل باستخدام أنابيب الطرد المركزي القابل للتصرف ، تعقيم البذور في محلول التبييض التجارية 10 ٪ (20 مل في البذور 20-40) لمدة 20 دقيقة مع اهتزاز على شاكر تدويري في 60 دورة في الدقيقة.
ملاحظة : يجب أن يتم تنفيذ كل الخطوات اللاحقة في تدفق الصفحي هود. - شطف البذور 4-7 مرات بالماء المعقم منزوع الأيونات مع الإثارة لطيف لمدة 30 ثانية خلال كل الشطف.
- مكان البذور العقيمة بين 5-6 طبقات من الورق مطوية موجودة في كل مربع أرجواني العقيمة.
- احتضان بذور لمدة 4 أيام وفقا للشروط التالية : 25 درجة مئوية ، 16 / 8 ح ضوء : الظلام و 40 ق μEm -2 -1.
II. مقدمة الجينات باستخدام القصف الجسيمات
- يبني بناء ناقلات الجينات باستخدام التعبير المفضلة لديك مع مراسل الجينات التي يمكن رصدها في الأنسجة الحية. وهندستها لدينا عدد نسخ عالية ناقلات التعبير مفيدة لمروج والتحليلات عنصرا المروج. يحتوي هذا الجين ناقلات GFP الذي يستخدم لتصور مروج / المروج وظيفة عنصر في الأنسجة المتحول.
- حوالي 1-2 ساعات قبل القصف النبتات المكوس ، والفاصوليا ليما من الإنبات والشتلات المعاطف إزالة البذور. وينبغي أن النبتات تكون مناسبة لقصف الأصفر إلى الضوء الأخضر ، مسطحة وخالية من أي ضرر يمكن أن تتداخل مع مزيد من تحليل الصور.
- النبتات مكان على مستنبت OMS تحتوي على أملاح MS 1 ، الفيتامينات B5 2 ، 3 ٪ والسكروز Gelrite 0.2 ٪ (5.7 درجة الحموضة) فورا بعد أن يستأصل.
- ترسيب الحمض النووي بناء على جسيمات التنغستن M10 (سيلفانيا ، تواندا ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة). في أنبوب 0.6 مل microfuge ، إضافة جزيئات التنغستن 25 ميكرولتر (ومعلق في جزيئات الماء المعقم ، 100 ملغ مل -1 ، قبل استخدام الحق) ، و 5 ميكرولتر الحمض النووي (1 ميكرولتر ميكروغرام -1) ، 25 ميكرولتر الكالسيوم 2،5 M كلوريد (سيغما الدريخ القط. C3881 - 500G) و 10 ميكرولتر 100 سبيرمدين ملم (سيغما القط. S - 2626). دوامة لفترة وجيزة إلى مزيج دقيق جميع المكونات.
- احتضان إعداد الحمض النووي على الجليد لمدة 5 دقائق. ثم ، لإزالة والتخلص من طاف 50 ميكرولتر.
- جزيئات الحمض النووي Resuspend المغلفة التي vortexing وإزالة فورا قسامة 2 ميكرولتر. كرر هذه الخطوة vortexing في كل مرة يتم استبعاد اي قسامة من الأنبوب. يجب أن تبقى الجزيئات المغلفة في الجليد وتستخدم في غضون 15 دقيقة.
- من خلال الجزء العلوي من مرشح المحاقن ، ومكان 2 ميكرولتر الجزيئات المغلفة في منتصف الشاشة التصفية. مكان وحدة التصفية التي تحتوي على جسيمات المغلفة في وحدة تصفية عقد الجسيمات داخل غرفة بندقية.
- وضع الجانب فلقة ليما الفول متجه نحو المحور حتى على الحاجز ووضع الحاجز الجسيمات في غرفة بندقية. يتم استخدام الحاجز ، والذي يتألف من شاشة ذاب في قاع الكأس ، ومنبرا لدعم الأنسجة أثناء القصف.
- قصف الأنسجة باستخدام بندقية الجسيمات (في هذه المنهجية ، ونحن نستخدم تدفق الجسيمات بسيطة وغير مكلفة بندقية 3 ، خنزير ، صممت في مختبرنا) على النحو التالي ؛ أ) فتح الصمام مما يؤدي الى فراغ لاخلاء القاعة ، ب) بعد الفراغ تصل 760 ملم (30 بوصة) من الزئبق ، وتفعيل اللولبي والإفراج عن الهليوم لدفع الجزيئات ، ج) بعد القصف الجسيمات ، وإغلاق صمام خط فراغ والإفراج عن فراغ باستخدام صمام العادم. ضغط الهليوم المستخدمة لتسريع الجزيئات هو 50 PSI.
- بعد الافراج عن فراغ ، وفتح باب الغرفة لاسترداد النبتات قصفت والعودة فلقة ، جنبا متجه نحو المحور تصل إلى مستنبت OMS.
ملاحظة : للحصول على القياس الكمي والتنميط التعبير ، ونحن قصف عادة لا تقل عن ثلاث النبتات الحمض النووي لكل بناء. عنصر تحكم الإيجابي ، الذي عادة ما يكون الحمض النوويبناء الذي يعطي التعبير الجيني مدروسة الجانبي ، يتم تضمين كمرجع.
III. صورة كوكتيل الآلي
- تشغيل مصباح الزئبق والانتظار لمدة 30 دقيقة للالمصباح في عملية الاحماء.
- بدوره على مصادر الطاقة لكاميرا CCD سبوت - RT (آلات التشخيص ، وشركة مرتفعات ستيرلنغ ، ميتشيغن ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، والروبوتات وحدة تحكم المحرك الأساسي ، مما يدفع حركة منصة الروبوتات.
- تعيين تعيين مرشح للكشف GFP (GFP2 تعيين مرشح ؛. تحويلة نانومتر 480/40 ، إم 510 ليرة لبنانية) على المجهر MZFLIII تشريح (لايكا ، Heerbrugg ، سويسرا).
- تعقيم متسمكة طبق بيتري أغطية البولي عن طريق الرش مع الايثانول 70 ٪. الأغطية المتخصصة ، ويستخدم لتغطية قاعدة طبق بيتري منع تكاثف خلال جمع الصور 4.
- وضع لوحات تحتوي على النبتات قصفت على منصة الروبوتات (Arrick الروبوتات ، هيرست ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) للنظام الآلي لجمع الصور. هو الدافع وراء منصة الروبوتات من قبل مجموعة السيارات التنقل ويتكون من الجدول المرفق لأطباق بتري 8. هي التي شيدت منصة البولي ، والبولي بروبيلين والألومنيوم. لوحات يتم تثبيتها في الموقف من خلال تشديد الوحشي من البلاستيك مجموعة المسمار.
- فتح التطبيق الذي يتحكم في البرامج المخصصة لكل من منصة الروبوتات والحصول على الصور. أيضا ، افتح البرنامج الضوء الأبيض تحكم التبديل.
- في علامة التبويب "حركة السيارات" ، انقر على "المحرك على" و "بيت متنقل". بعد البرنامج يوجه منصة لموقف البيت ، ونحن مستعدون لبدء الدخول في صفقات على كل فلقة.
- في علامة التبويب "حركة السيارات" ، حدد لوحة الأولى. فإن منصة موقف وسط صحن بيتري تحت المجهر هدف. باستخدام أزرار مسافة الانتقال ، على وجه التحديد موقف فلقة الأول لجمع الصور. مع وحدة تحكم في الضوء الأبيض ، يمكن ملاحظة أن المنطقة المستهدفة من خلال شاشة الكمبيوتر عن طريق تشغيل "العيش وضع" الميزة.
- للفلقة الأول ، تعيين التركيز والتكبير (يفضل التكبير 1.6x) باستخدام المقابض دليل على مجهر تشريح. يتم إجراء التعديلات تركز على النبتات المتبقية على لوحة نفسه باستخدام مسامير تسوية ثلاث تقع أسفل كل لوحة ، وعلى منصة الروبوت.
- مرة واحدة وقد تم تعيين المنطقة من الاهتمام ، انقر فوق "إضافة هذا الموقف" الزر. يقوم البرنامج بإضافة إحداثيات هذه المنطقة إلى وضع جدول زمني الملف وسيعود الى منصة في وسط اللوحة.
- مجموعة المواقف والتركيز على النبتات جميع المتبقية على لوحات باستخدام أزرار المسافة المتحركة ومسامير التسوية اليدوية. بعد أن تم إدخال جميع إحداثيات جميع النبتات ، حفظ جدول إحداثيات الموقف.
- أدخل المعلمات جمع الصور. في علامة التبويب "صورة الإعداد" ، حدد نوع من الضوء المطلوب ؛ بيضاء أو زرقاء. للكشف عن GFP ، ينبغي ألا تستخدم إلا في اللون الأزرق الفاتح. أيضا ، يدخل في مكان التعرض. على الرغم من أننا يمكن تعديل وقت التعرض بشكل مستقل عن اللون الأحمر والأزرق والأخضر ، ونحن عادة استخدام نفس الإعدادات لGFP الصور وثائق (20 و 14 و 14 ثانية للأحمر ، وقنوات خضراء وزرقاء ، على التوالي) مما يسمح لنا لجعل المباشرة و يتفق المقارنات بين الحمض النووي بنيات مختلفة.
- في نفس التبويب "صورة الإعداد" ، حدد مجلد فارغ حيث سيتم تخزين الصور. سيتم حفظ كل سلسلة من الصور داخل هذا المجلد الرئيسي في مجلدات مستقلة ، مرقمة بالتسلسل وفقا لترتيب المواقف دخلت لالنبتات.
- انتقل إلى "وقت التقاط السيطرة" التبويب وضبط الوقت الفاصل اقتناء الصور والعدد الإجمالي للدورات من جمع الصور. عادة ما يتم جمع الصور في كل ساعة لمدة 100 ساعة ، وتوليد محددة جيدا ملامح التعبير الجيني.
- بدء الحصول على الصور من خلال النقر على "الجدول الزمني البعيد!" الزر الموجود في علامة التبويب "موقف الجدول الزمني".
- في نهاية جمع 100 صورة ح ، ونقل كافة الصور من جهاز الكمبيوتر السيطرة على الروبوت إلى أي محرك أقراص ذات سعة كبيرة الثابت أو الكمبيوتر للحصول على مزيد من تحليل الصور. يتم جمع صور عالية الدقة (1600 x 1200 بكسل) على شكل ملفات TIF قياس ~ 5 ميغابايت لكل منهما.
رابعا. تحليل الصور
- تجميع الصور 100 متسلسلة من كل مجلد باستخدام Adobe ImageReady ، و
- فتح ImageReady واستيراد كل الصور المتسلسلة ويؤلف سلسلة الإطارات.
- تغيير حجم الصور الأصلية إلى 800 × 600 بكسل. الصور التي تم جمعها وارتفاع القرار ، والذي يولد الملفات الكبيرة التي يمكن أن تجعل معالجة الصور بطيئة.
- التمرير من خلال الصور والعثور على بقعة (ق) واضحة في معظم الصور.
- تكبير تصل إلى 300 ٪ على الفور المختارة (ق). محاذاة الصور باستخدام أعلى التكبير يسمح لتسجيل أكثر دقة.
- اضافة الى وجود طبقة على رأس كل الصور واضحة تجعل من المؤكد في جميع الأطر. علامة البقعة (ق) الموقع باستخدام "الرسام" أداة.
- بدء التوفيق بين جميع الأطر باستخدام "النقلة" أداة وأخذ علامات على طبقة كمرجع.
- عند اكتمال المحاذاة ، حذف طبقة تستخدم كمرجع وحفظ الصور في ملف واحد "مديرية الأمن العام". أيضا ، تصدير جميع الأطر وملف واحد "وسائل التحقق" باستخدام أعلى دقة. محاذاة الخط من كل سلسلة يأخذ صورة ~ 10 دقيقة.
- أداء الكمي في التعبير الجيني باستخدام ImageJ.
- حفظ ImageJ فتح البرامج وفتح "وسائل التحقق" ملف مسبقا في ImageReady ، و
- باستخدام أداة تحديد ، اختيار 400 × 300 بكسل المنطقة والمحاصيل الصورة. يجب حفظ هذا الملف الجديد كملف "افي".
- فصل صور متسلسلة ، الموجود في ملف جديد "افي" إلى قنوات الأحمر والأزرق والأخضر بالنقر على "صورة" ، "اللون" و "RGB انقسام" في ImageJ.
- طرح مضان الخلفية من جميع الصور في قنوات خضراء وحمراء. باستخدام سلسلة قناة الاخضر صورة ، حدد 20 × 20 بكسل المنطقة من المنطقة مع الخلايا غير الإعراب وسجل موقعه في الأداة "إدارة العائد على الاستثمار" ، بحيث سيتم اختيار المنطقة نفسها في كل القنوات. مع مربع × 20 بكسل 20 نشطا في قناة خضراء ، انتقل إلى الأمر "الإضافات" الموجود في شريط المهام من ImageJ ثم انقر على "قياس العائد على الاستثمار لطرح كل شريحة" المساعد الأدوات.
- في ImageJ ، انقر على "صورة" ، "تعديل" ثم "العتبة" لتعريف أو قطعة GFP - معربا عن بكسل. ضبط مستويات عتبة عن طريق سحب شريط في إطار الحد الأدنى للحصول على متوسط حجم البقعة من 20-30 بكسل.
- تحديد التعبير GFP باستخدام البرنامج المساعد أننا المصممة لقياس القيمة الرمادي يعني لكل بكسل والعدد الإجمالي للتعبير عن GFP - بكسل.
- نسخة الإخراج يعني الرمادي القيم في ImageJ ولصقها في برنامج Microsoft Office Excel. حساب GFP التعبير عن كل قناة (الأحمر والأخضر) بضرب يعني الرمادي قيمة لكل بكسل من العدد الإجمالي للتعبير عن GFP - بكسل لكل قناة. مجموع القيم التعبير عن كلتا القناتين يعطي التعبير GFP. يمكن استخدامها لتوضيح القيم ملامح التعبير الجيني وإجراء المقارنات المباشرة. يمكن أن يكون الوقت الفاصل بين الرسوم المتحركة ولدت أيضا باستخدام "وسائل التحقق" أو الملفات "افي" ، وتوفير رؤية واضحة وفريدة من الجينات الشخصية التعبير.
خامسا نتائج الممثل
وذكرت وجمع وتحليل الصور الروبوتية الداخلي (الشكل 1) يسمح هنا الاستحواذ على كمية كبيرة من البيانات الكمية على التعبير الجيني في فترة زمنية قصيرة. لتوصيف المروج المصنع باستخدام الجينات GFP ، هذه المنهجية ليست فقط مفيدة لخلق ملامح التعبير عابرة (الشكل 2) ، ولكن أيضا لتعقب في تعبير GFP - مفصلة بطريقة عابرة في الأنسجة النباتية وثابت ، تحولت 5،6. باختصار الوقت الفاصل بين الرسوم المتحركة ولدت مع صور متتابعة على جمعها هي أداة قيمة للتحليلات متعمقة في التعبير الجيني على مر الزمن في الأنسجة النباتية. هذه المنهجية أيضا الطلب الكبير لتقييم العوامل التي تؤثر بشكل مباشر على التعبير الجيني. على سبيل المثال ، تم التعبير GFP عابر تحت جود المكثفات مختلفة من إسكات المنشأ الفيروسي دراستها بنجاح باستخدام جمع صورتنا الآلي ونظام تحليل 7،8.
تحليل الصور الرقم 1. الداخلي يتكون من أربع خطوات رئيسية. (أ) اقتناء سلسلة الصور باستخدام مجموعة الروبوتية صورة النظام ، (B) فصل من الصور إلى قنوات الأحمر والأزرق والأخضر ، (C) تجزئة بكسل معربا عن طريق ضبط مستويات العتبة ، و (د) الحصول على نتائج الإخراج الذي يحتوي على القيم والرمادي GFP - معربا عن العد التركيز.
الشكل 2. رسم بياني يبين مختلف التشكيلات التعبير عابرة يقودها المروجين مصنع لصهر GFP. وقد تم جمع البيانات باستخدام لدينا مجموعة الصور الروبوتية النظام وتحليلها مع ImageReady ImageJ والبرمجيات.
Discussion
استخدام الروبوتات وتطبيقات هائلة في مختلف جوانب الحياة البشرية ، على وجه التحديد ، تم الروبوتات تستخدم بفعالية لتنفيذ الأنشطة في بيئات خطرة ، لأتمتة أنشطة شاقة ومعقدة ، والقيام بالمهام بطريقة أكثر دقة. في البيولوجيا الجزيئية ، وعلى وجه التحديد التحليلات التعبير الجيني ، يمكن أن تساعد في تتبع الروبوتات ليس فقط ملامح الجينات ، بل أيضا نمو الأنسجة والتطور على مر الزمن. تحدث العديد من الظواهر البيولوجية بشكل حيوي ، والتي قد يكون من الصعب تتبع باستخدام نقطة واحدة الملاحظات الوقت.
استخدام الجين GFP للدراسات التعبير يجلب مزايا إضافية لمراقبة استجابة الأنسجة والنمو. لإجراءاتنا التجريبية ، GFP يسمح لنا لمتابعة التعبير الجيني في نفس قطعة من النسيج مع مرور الوقت كما هو GFP الكشف غير الهدامة. علاوة على ذلك ، لدينا نسخة من البروتين GFP غير مستقرة بما فيه الكفاية للسماح للكشف ولكنه يظهر أيضا بعض الدوران للحد من تراكم في أنسجة النبات ، مما يتيح لنا متابعة كل من صعود وهبوط في التعبير الجيني.
وقد استخدمت بالفعل نحن لدينا مجموعة الصور الروبوتية ونظام تحليل لمجموعة واسعة من التطبيقات. نتوقع إمكانية كبيرة لكثير من التطبيقات البيولوجية حيث هو المطلوب فهم الديناميكية لهذه الظاهرة. على سبيل المثال ، يمكن تتبع نمو وتطور الأنسجة النباتية باستخدام نظامنا يعطي نظرة قيمة / معلومات عن هذه العمليات. أيضا ، وديناميات النقل باستخدام جينات بروتين مثل مراسل GFP ، يمكن تصور بسهولة باستخدام الوقت الفاصل بين الرسوم المتحركة. المنهجية الموصوفة في هذا التقرير هو معقدة تقنيا ولكنها بسيطة من الناحية المفاهيمية. نتائجنا القوية والتي يتم اكتشافها باستمرار التطبيقات الجديدة التي يجري.
Acknowledgments
وقدمت رواتب ودعم البحوث من قبل المجلس فول الصويا المتحدة ، وعبر الولاية والحكومة الفيدرالية الأموال المخصصة للبحث الزراعي جامعة ولاية أوهايو / أوهايو ومركز تنمية كما أيد هذا البحث جزئيا من CONACYT الزمالة ، والمكسيك ، لCMHG. ذكر العلامة التجارية أو المنتجات ذات الملكية لا يشكل ضمانة أو ضمان للمنتج من قبل جامعة ولاية أوهايو / OARDC وأيضا لا يعني الموافقة على استبعاد غيرها من المنتجات التي قد تكون مناسبة أيضا. مجلة المادة لا HCS 09-17.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ | Software | National Institutes of Health | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15, 473-497 (1962).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res. 50, 150-158 (1968).
- Finer, J. J., Vain, P., Jones, M. W., McMullen, M. D. Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells. Plant Cell Rep. 11, 232-238 (1992).
- Finer, J. E., Finer, J. J. A simple method for reducing moisture condensation on Petri dish lids. Plant Cell Tiss Org. 91, 299-304 (2007).
- Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. Comparative analysis of 35S and Lectin promoters in transgenic soybean tissue using an automated image acquisition system and image analysis. Plant Cell Rep. 25, 290-296 (2006).
- Chiera, J. M., Bouchard, R. A., Dorsey, S. L., Park, E. H., Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. Isolation of two highly active soybean (Glycine max (L.) Merr.) promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system. Plant Cell Rep. 26, 1501-1509 (2007).
- Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. Quantification and extension of transient GFP expression by the co-introduction of a suppressor of silencing. Transgenic Res. 17, 1143-1154 (2008).
- Dhillon, T., Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. Quantitative evaluation of six different viral suppressors of silencing using image analysis of transient GFP expression. Plant Cell Rep. 28, 639-647 (2009).
