Robótica y Análisis de Imagen Dinámica de Estudios de la expresión génica en los tejidos vegetales

Summary

Se presenta un método para la introducción, el seguimiento y el análisis cuantitativo de la expresión de GFP en las células vegetales. Este método utiliza un sistema diseñado a la robótica para la colección de imágenes semi-permanente de un gran número de muestras, con el tiempo. También demostrar el uso de ImageJ e ImageReady para el análisis de series de imágenes.

Abstract

La expresión de genes en los tejidos vegetales suele ser estudiado por la extracción destructiva de los compuestos de tejidos de la planta de

Protocol

La siguiente metodología describe un protocolo para el análisis de la imagen de la expresión génica mediante un sistema de recogida automatizada de imágenes. Para facilitar la explicación, el planteamiento general se divide en cuatro pasos: 1) la preparación de semillas, 2) la introducción de genes mediante el bombardeo de partículas, 3) colección de imágenes de robots, y 4) el análisis de imágenes. Aunque esta metodología general se puede utilizar para una amplia gama de otras aplicaciones, los conjuntos de la actualidad de los protocolos se basan en el uso de la proteína verde fluorescente (GFP) de genes, que es un gen útil para el seguimiento de la expresión de genes en la misma pieza de los tejidos vivos con el tiempo.

I. Preparación de la semilla

1. Frijol de Lima (. Phaseolus lunatus cv Henderson-Bush) se pueden comprar semillas o, idealmente, cosecha de las plantas cultivadas en una cámara de crecimiento (50% de humedad relativa, 16 / 8 h luz: oscuridad, 25/23 ° C día / noche). Después de la cosecha de semillas de calidad puede ser mantenido por el almacenamiento de semillas a -20 ° C.
2. Prepare Magenta GA7 contenedores para la germinación de las semillas. Doble el papel de filtro o servilletas de papel para que quepa en la parte inferior de las cajas de Magenta. Añadir aproximadamente 25 ml de agua desionizada a cada contenedor para humedecer las toallas de papel, y vierta el agua absorbida. Autoclave humedecido de papel que contienen las cajas durante 20 minutos.
3. Utilizando tubos de 50 ml centrífuga desechables, esterilización de las semillas en una solución de lejía al 10% comerciales (20 semillas de 20-40 ml) durante 20 minutos con agitación en un agitador giratorio a 60 rpm.
   Nota: Todos los pasos posteriores se deben realizar en una campana de flujo laminar.
4. Enjuague las semillas 4-7 veces con agua estéril desionizada agitando suavemente durante 30 segundos en cada lavado.
5. Coloque 5-6 semillas estériles entre las capas de papel doblado encuentra en cada caja Magenta estéril.
6. Incubar las semillas durante 4 días bajo las siguientes condiciones: 25 ° C, 16 / h de luz 8: oscura y el 40 μEm ^-2 s ^-1.

II. Introducción de genes con el bombardeo de partículas

1. Construir construcciones de genes utilizando el vector de expresión favorita con un gen que puede ser controlada en los tejidos vivos. Hemos desarrollado un gran número copia vector de expresión útil para el promotor y el promotor de análisis de elementos. Este vector contiene el gen de la GFP, que se utiliza para visualizar el promotor / la función de promotor elemento en los tejidos transformados.
2. Alrededor de 1-2 horas antes del bombardeo, los cotiledones al consumo de habas la germinación de semillas y retire la cubierta de la semilla. Cotiledones adecuado para el bombardeo debe ser de color amarillo a verde claro, liso y libre de cualquier daño que pueda interferir con el análisis de imágenes más.
3. Cotiledones lugar en medio de cultivo que contienen sales de OMS MS ^{1, 2} vitaminas B5, 3% de sacarosa y 0,2% Gelrite (pH 5,7) inmediatamente después de ser extirpado.
4. Precipitar el constructo de ADN en M10 partículas de tungsteno (Sylvania, Towanda, PA, EE.UU.). En un tubo de 0,6 ml de microfuga, añadir 25 partículas de tungsteno l (partículas se resuspenden en agua destilada, 100 mg ml ^-1, a la derecha antes de su uso), 5 l de ADN (1 mg l ^-1), 25 l de cloruro de calcio 2,5 M (Sigma -Aldrich cat. C3881-500G) y 10 l 100 mM espermidina (Cat. Sigma. S-2626). Vortex brevemente para mezclar bien todos los componentes.
5. Incubar la preparación de ADN en hielo durante 5 min. Luego, retirar y desechar el sobrenadante 50 microlitros.
6. Resuspender las partículas recubiertas de ADN por agitación e inmediatamente retirar una alícuota de 2 l. Repita este paso agitación cada vez que se elimina una parte alícuota del tubo. Partículas recubiertas se deben mantener en hielo y se utiliza dentro de los 15 min.
7. A través de la parte superior de un filtro de jeringa, coloque dos partículas recubiertas l en el centro de la malla del filtro. Coloque la unidad de filtro que contiene las partículas recubiertas en la unidad de la celebración de filtro en la cámara de cañón de partículas.
8. Colocar una haba lado adaxial cotiledón hasta en un bafle y colocar el deflector en la cámara de cañón de partículas. El deflector, que consiste en una pantalla fundida en el fondo de un vaso de precipitados, se utiliza como una plataforma para apoyar a los tejidos durante el bombardeo.
9. Bombardear a los tejidos, utilizando un cañón de partículas (en esta metodología, se utiliza un cañón de partículas flujo de entrada sencilla y económica ^3, PIG, diseñado en nuestro laboratorio) de la siguiente manera: a) abrir la válvula que lleva a la de vacío para evacuar la cámara, b) después de el vacío llega a 760 mm (30 pulgadas) de Hg, activar el solenoide y liberar el helio para propulsar las partículas, c) después del bombardeo de partículas, cierre la válvula de la línea de vacío y liberar el vacío con la válvula de escape. La presión de helio utilizado para acelerar las partículas es de 50 PSI.
10. Después de que el vacío se libera, abre la puerta de la cámara para recuperar los cotiledones bombardeados y volver el cotiledón, el lado adaxial arriba, al medio de cultivo OMS.
    
    Nota: Para la cuantificación y el perfil de expresión, por lo general bombardean a un mínimo de tres cotiledones de cada constructo de ADN. Un control positivo, que suele ser un ADNconstructo que da un perfil genético bien estudiado expresión, se incluye como referencia.

III. Colección de imágenes automatizado

1. Encienda la lámpara de mercurio y esperar 30 minutos para que la lámpara se caliente.
2. A su vez en las fuentes de alimentación para la cámara CCD Spot RT (Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, Michigan, EE.UU.) y la plataforma robótica controlador de motor, que impulsa el movimiento de la plataforma robótica.
3. Establecer el conjunto de filtros para la detección de buenas prácticas agrarias (GFP2 conjunto de filtros,.. Ex 480/40 nm, Em 510 LP) en un microscopio de disección MZFLIII (Leica, Heerbrugg, Suiza).
4. Esterilizar el engrosamiento de policarbonato tapas de caja de Petri por pulverización con etanol al 70%. Las tapas especializados, que se utiliza para cubrir la base de una placa de Petri evitar la condensación durante la recolección de la imagen ^4.
5. Coloque las placas que contienen los cotiledones bombardeados en la plataforma robótica (Arrick Robótica, Hurst, Texas, EE.UU.) del sistema de recogida automatizada de imágenes. La plataforma robótica está impulsada por un conjunto de motor paso a paso y consiste en una mesa para la fijación de 8 cajas de Petri. La plataforma está construida en policarbonato, polipropileno y aluminio. Las placas se fijan en su posición apretando un plástico lateral tornillo de ajuste.
6. Abra la aplicación de software a medida que controla tanto la plataforma robótica y la adquisición de imágenes. Además, abre el software de controlador de luz blanca cambiar.
7. En el "movimiento del motor", haga clic en "motor encendido" y "casa rodante". Después de que el software de la plataforma se orienta a la posición inicial, estamos listos para comenzar a introducir las posiciones de todos los cotiledones.
8. En el "movimiento del motor", seleccione la primera placa. La plataforma será la posición del centro de la placa de Petri en el objetivo del microscopio. Con los botones de distancia en movimiento, precisamente, la posición del cotiledón primera colección de imágenes. Con el controlador de la luz blanca en la región de destino puede ser observada a través de la pantalla del ordenador mediante la activación del "modo en vivo".
9. Para el cotiledón en primer lugar, establecer el enfoque y la ampliación (aumento de 1,6 x se prefiere) con los mandos manuales en el microscopio de disección. Enfoque ajustes para el resto de los cotiledones en la misma placa se realiza mediante tres tornillos de nivelación que se encuentra debajo de cada plato, en la plataforma robótica.
10. Una vez que la región de interés se ha creado, haga clic en "agregar esta posición" botón. El software añade las coordenadas de esta región a un archivo de programación de la posición y la plataforma volverá al centro de la placa.
11. Coloque las posiciones y enfoque para todos los cotiledones quedan en los platos con los botones de distancia del movimiento y los tornillos manuales de nivelación. Después de todas las coordenadas de todos los cotiledones se han introducido, guardar las coordenadas del horario de posición.
12. Introduzca los parámetros de la colección de imágenes. En el "ajuste de imagen", seleccione el tipo de luz deseado, blanco o azul. Para la detección de buenas prácticas agrarias, sólo la luz azul se debe utilizar. Por otra parte, entrar en el ajuste de la exposición. A pesar de que puede modificar el tiempo de exposición de manera independiente de color rojo, azul y verde, que suelen utilizar la misma configuración para las buenas prácticas agrarias documentación fotográfica (20, 14 y 14 segundos para el canal rojo, verde y azul, respectivamente) lo que nos permite realizar directa y comparar de forma homogénea entre los constructos de ADN diferente.
13. En el mismo "ajuste de imagen" ficha, especifique una carpeta vacía donde las imágenes se almacenarán. Cada serie de imágenes se guardarán en la carpeta principal en carpetas independientes, numeradas correlativamente según el orden de las posiciones de entrada de los cotiledones.
14. Ir al "tiempo de tomar el control" y configure la adquisición de la imagen intervalo de tiempo y el número total de ciclos de colección de imágenes. Las imágenes se suelen recoger cada hora durante 100 horas, lo que genera bien definidos los perfiles de expresión génica.
15. Iniciar la adquisición de imágenes haciendo clic en el "horario de correr!" botón situado en el "horario de posición" ficha.
16. Al final de la colección de imágenes de 100 horas, la transferencia de todas las imágenes de la computadora que controla el robot a cualquier unidad de disco duro de gran capacidad o equipo de análisis de imágenes más. Imágenes de alta resolución (1600 x 1200 píxeles) se recogen como archivos TIF medir ~ 5 Mb cada uno.

IV. Análisis de Imágenes

1. Montar las 100 imágenes secuenciales de cada carpeta con Adobe ImageReady.
   1. Abrir ImageReady e importar todas las imágenes secuenciales que componen una serie de marcos.
   2. Cambiar el tamaño de las imágenes originales de 800 x 600 píxeles. Imágenes recogidas son de alta resolución, que genera archivos de gran tamaño que pueden hacer lento el procesamiento de imágenes.
   3. Desplácese por las imágenes y encontrar un punto (s) visible en la mayoría de las imágenes.
   4. Zoom hasta 300% en el lugar seleccionado (s). Alineación de imágenes con un mayor aumento, permite un registro más preciso.
   5. Insertar una capa en la parte superior de todas las imágenes y asegúrese de que está visible en todos los marcos. Marque el punto (s) localización usando el "Pincel" de herramientas.
   6. Iniciar la aproximación de los marcos con el "traslado" de la herramienta y de tomar las marcas en la capa de referencia.
   7. Cuando la alineación está completa, eliminar la capa utilizada como referencia y guardar las imágenes como una sola "psd" archivo. Por otra parte, las exportaciones de todos los fotogramas como una única "mov" archivo con la resolución más alta. La alineación manual de cada serie de imágenes lleva alrededor de 10 min.
2. Realizar la cuantificación de la expresión génica utilizando ImageJ.
   1. Abra el software ImageJ y abrir el "mov" archivo guardado previamente en ImageReady.
   2. Con la herramienta Seleccionar, elija un área de 400 x 300 píxeles y recortar la imagen. Este nuevo archivo debe ser guardado como un archivo "AVI".
   3. Separar las imágenes secuenciales, que se encuentra en el nuevo archivo "AVI" en los canales rojo, azul y verde, haga clic en "imagen", "color" y "split RGB" en ImageJ.
   4. Reste la fluorescencia de fondo de todas las imágenes de los canales verde y rojo. Utilizando la serie de imagen de canal verde, seleccione un área de 20 x 20 píxeles de una región con no expresan las células y registrar su ubicación en el "Administrador de retorno de la inversión" de la herramienta, por lo que la misma área serán seleccionados en ambos canales. Con el cuadrado de 20 x 20 píxeles activos en el canal verde, ir a los "plugins" comando ubicado en la barra de tareas de ImageJ y luego haga clic en el "retorno de la inversión restar medida para cada sector" plugin-herramienta.
   5. En ImageJ, haga clic en "Imagen", "ajuste" y luego "umbral" para definir o segmento de la GFP-expresando píxeles. Ajustar los niveles de umbral, arrastre la barra en la ventana de umbral para obtener un tamaño de spot promedio de 20 a 30 píxeles.
   6. Determinar la expresión de GFP usando un plugin que hemos diseñado para medir la media en escala de grises por píxel valor y el número total de píxeles que expresan GFP.
   7. Copia de la producción media en escala de grises valores en ImageJ y pegar en Microsoft Office Excel. Calcular la expresión de GFP para cada canal (rojo y verde), multiplicando la media en escala de grises por píxel valor por el número total de píxeles que expresan GFP para cada canal. La suma de los valores de expresión de ambos canales se obtiene la expresión de GFP. Los valores pueden ser utilizados para ilustrar los perfiles de expresión génica y hacer comparaciones directas. Time-lapse animaciones también pueden ser generados usando "mov" o archivos "avi", proporcionando una visualización única y clara del perfil de expresión génica.

V. Los resultados representativos

La colección de imágenes y robótica procedimiento de análisis (Fig. 1) que aquí permite la adquisición de una gran cantidad de datos cuantitativos sobre la expresión génica en un corto período de tiempo. Para la caracterización de la planta con el promotor del gen de la GFP, esta metodología no sólo es útil para crear perfiles de expresión transitoria (Fig. 2), sino también para realizar un seguimiento en una expresión de GFP-detallada en forma transitoria y tejidos de las plantas transformadas de forma estable ^5,6. Corto lapso de tiempo, animaciones generadas con las imágenes recogidas secuencial son una herramienta valiosa para el análisis en profundidad de la expresión génica en el tiempo en los tejidos vegetales. Esta metodología también tiene gran aplicación para evaluar los factores que afectan directamente a la expresión génica. Por ejemplo, la expresión de GFP transitoria bajo la presencia de diferentes supresores del silenciamiento de origen viral ha sido estudiada con éxito con nuestra colección de imágenes automatizado y sistema de análisis de ^7,8.

Figura 1. Procedimiento de análisis de imagen consta de cuatro pasos principales. (A) La adquisición de una serie de imágenes utilizando el sistema robótico de la colección de imágenes, (b) la separación de las imágenes en los canales rojo, azul y verde, (C) distribución de los píxeles que expresan mediante el ajuste de los niveles de umbral, y (D) la obtención de los resultados de salida que contiene los valores de la escala de grises y el recuento de las buenas prácticas agrarias-que expresa el enfoque.

Figura 2. Gráfico que muestra los diferentes perfiles de expresión transitoria impulsado por promotores de la planta fusionado a GFP. Los datos fueron recolectados a través de nuestro sistema robótico colección de imágenes y análisis con ImageReady y el software ImageJ.

Discussion

El uso de la robótica tiene aplicaciones enormes en diferentes aspectos de la vida humana, en concreto, los robots han sido efectivamente utilizados para realizar actividades en ambientes peligrosos, para automatizar las actividades tediosas y complejas, y llevar a cabo las tareas de una manera más precisa. En la biología molecular, y analiza específicamente la expresión de genes, los robots pueden ayudar a rastrear no sólo las características de los genes, sino también el crecimiento del tejido y el desarrollo en el tiempo. Muchos fenómenos biológicos ocurren de forma dinámica, lo que puede ser difícil de seguir utilizando un solo punto de observación del tiempo.

El uso del gen de la GFP para estudios de expresión ofrece ventajas adicionales para la observación de la respuesta del tejido y el crecimiento. Para nuestros procedimientos experimentales, las buenas prácticas agrarias que nos permite seguir la expresión de genes en el mismo pedazo de tejido en el tiempo como la detección de GFP es una organización no-destructiva. Por otra parte, nuestra versión de la proteína GFP es lo suficientemente estable para permitir la detección, pero también muestra una cierta rotación para minimizar la acumulación en los tejidos vegetales, lo que nos permite seguir tanto en el ascenso y la caída de la expresión génica.

Ya hemos utilizado nuestra colección de imágenes robótico y un sistema de análisis para una amplia gama de aplicaciones. Prevemos un gran potencial para muchas aplicaciones biológicas donde se desea una comprensión dinámica de un fenómeno. Por ejemplo, el crecimiento y el desarrollo de tejidos de la planta puede seguir utilizando nuestro sistema de dar información valiosa / información sobre estos procesos. Además, la dinámica del transporte de proteínas utilizando genes reporteros, como las buenas prácticas agrarias, se puede visualizar fácilmente el uso del tiempo-lapso animaciones. La metodología descrita en este informe es técnicamente complejo, pero sencillo conceptualmente. Nuestros resultados son robustos y las nuevas aplicaciones están continuamente siendo descubierto.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ	Software	National Institutes of Health		http://rsbweb.nih.gov/ij/