Robotics och Dynamic bildanalys för studier av genuttryck i plantvävnader

Summary

Vi rapporterar en metod för introduktion, spårning och kvantitativ analys av GFP uttryck i växtceller. Den här metoden använder ett skräddarsytt robotsystem för halvkontinuerlig bildsamling från ett stort antal prover, över tid. Vi visar också användningen av ImageJ och ImageReady för analys av bild-serien.

Abstract

Genuttryck i plantvävnader är typiskt studeras genom destruktiva utvinning av ämnen från växt vävnader för

Protocol

Följande metoder beskriver ett protokoll för bildanalys av genuttryck med hjälp av ett automatiserat system bildsamling. För att underlätta förklaring var den övergripande strategin delas upp i fyra steg: 1) frö förberedelse, 2) genen Inledning Använda partikel bombardemang, 3) robotliknande bildsamlingen, och 4) bildanalys. Även om denna allmänna metod kan användas för ett brett spektrum av andra applikationer, är de aktuella uppsättningar av protokoll som bygger på användning av det grönt fluorescerande protein (GFP) gen, vilket är en bra reporter gen för att spåra genuttryck i samma stycke av levande vävnad över tiden.

I. Seed Förberedelser

1. Lima bönor (. Phaseolus lunatus cv Henderson-Bush) frön kan köpas, eller helst skördas från växter som odlas i en tillväxt kammare (50% relativ luftfuktighet, 16 / 8 h ljus: mörk, 25/23 ° C dag / natt). Efter skörd utsädeskvalitet kan bibehållas genom att lagra frön vid -20 ° C.
2. Förbered Magenta GA7 behållare för groende frön. Vik filter eller pappershandduk för att passa i botten av Magenta lådor. Tillsätt ~ 25 ml avjoniserat vatten till varje container för att fukta hushållspapper och häll av icke-absorberat vatten. Autoklav fuktat papper som innehåller rutor för 20 min.
3. Med 50 ml engångs centrifugrör, sterilisera frön i en 10% kommersiellt blekmedel lösning (20 frön i 20-40 ml) i 20 min med att skaka på en spindelkross skak vid 60 rpm.
   Notera: Alla efterföljande steg ska utföras i ett laminärt flöde huva.
4. Skölj fröna 4-7 gånger med sterilt avjoniserat vatten under försiktig omrörning i 30 sekunder under varje sköljning.
5. Placera 5-6 sterila frön mellan lager av vikt papper som ligger i varje sterila Magenta låda.
6. Inkubera frön under 4 dagar enligt följande villkor: 25 ° C, 16 / 8 h ljus: mörkt och 40 μEm ^-2 s ^-1.

II. Gene Inledning med Particle beskjutning

1. Bygga gen konstruktioner med hjälp av din favorit uttryck vektor med en reporter gen som kan övervakas i levande vävnader. Vi har utvecklats ett högt antal kopior uttryck vektor användbar för promotor och promotor analyser element. Denna vektor innehåller GFP-genen som används för att visualisera promotor / promotor inslag funktion i förvandlas vävnader.
2. Runt 1-2 timmar före beskjutningen, punktskatter lima bönor hjärtbladen från att gro plantor och ta bort fröna rockar. Hjärtbladen lämplig för beskjutning ska vara gul till ljust grönt, platt och utan några skador som kan störa ytterligare bildanalys.
3. Placera hjärtbladen på OMS odlingsmedium innehållande MS salter ^1, B5 vitaminer ^2, 3% sackaros och 0,2% Gelrite (pH 5,7) omedelbart efter censurerade.
4. Fällning DNA bygga på M10 volfram partiklar (Sylvania, Towanda, PA, USA). I ett 0,6 ml mikrofugrör, tillsätt 25 l volfram partiklar (partiklar suspenderade i sterilt vatten, 100 mg ml ^-1, precis innan användning), 5 l-DNA (1 mikrogram l ^-1), 25 l 2,5 M kalciumklorid (Sigma -Aldrich Kat. C3881-500g) och 10 l 100 mM spermidine (Sigma Kat. S-2626). Vortex kort blanda alla komponenter.
5. Inkubera DNA-preparation på is i 5 min. Ta sedan bort och kasta 50 l supernatanten.
6. Resuspendera DNA-belagda partiklar genom att vortexa och omedelbart ta bort en 2 l delmängd. Upprepa detta vortexa steg varje gång en alikvot tas bort från röret. Belagda partiklar bör förvaras i is och användas inom 15 min.
7. Genom toppen av en spruta filter, placera 2 l belagda partiklar i mitten av filtret skärmen. Placera filtret enhet som innehåller den belagda partiklar i filtret hålla inuti partikeln pistol kammaren.
8. Placera en lima böna hjärtbladsnod adaxial uppåt på en baffel och placera baffeln i partikeln pistolen kammaren. Baffeln, som består av en skärm smält till botten av en bägare, används som en plattform för att stödja vävnader vid bombardemanget.
9. Bombard i vävnaderna med hjälp av en partikel Gun (i denna metod, använder vi en enkel och billig Gun partikelfysik Inflöde ^3, gris, utformad i vårt laboratorium) enligt följande, a) öppna ventilen som leder till vakuum att evakuera kammaren, b) efter vakuum når 760 mm (30 in) Hg, aktivera magnetventilen och släpp helium för att driva partiklar, c) efter partikel bombardemang, stäng ventilen vakuum linjen och släpper vakuum med avgasventil. Helium tryck som används för att accelerera partiklarna är 50 PSI.
10. Efter vakuum släpps, öppnar luckan för att hämta bombarderade hjärtbladen och tillbaka hjärtbladsnod, adaxial uppåt till OMS odlingsmedium.
    
    Obs: För kvantifiering och uttryck profilering, vi brukar bombardera minst tre hjärtblad för varje DNA-konstruktion. En positiv kontroll, som vanligtvis är en DNA-konstruktion som ger en väl studerade profil genuttryck, ingår som en referens.

III. Automatiserad bildsamling

1. Slå på kvicksilverlampa och vänta 30 min för lampan att värmas upp.
2. Slå på strömmen källor för Spot-RT CCD-kamera (diagnostiska instrument Inc., Sterling Heights, MI, USA) och robotik plattformen motorns styrenhet, som driver rörelse Robotics plattform.
3. Ställ in filtret in för GFP detektion (GFP2 filter infattade;.. Ex 480/40 nm, EM 510 LP) på en MZFLIII dissekera mikroskop (Leica, Heerbrugg, Schweiz).
4. Sterilisera förtjockad polykarbonat petriskålen lock genom att spraya med 70% etanol. De specialiserade lock, används för att täcka petriskål basen förhindra kondens under bildsamling ^4.
5. Placera plattorna innehåller bombarderade hjärtbladen på Robotics plattform (Arrick Robotics, Hurst, TX, USA) av automatiserade bilden insamlingssystemet. Den Robotics Plattformen drivs av en stegmotor set och består av en tabell för infästning av 8 petriskålar. Plattformen är tillverkad av polykarbonat, polypropylen och aluminium. Plattorna fästs på plats genom att dra åt en lateral plast set-skruven.
6. Öppna den anpassade program som styr både robotik plattform och bildtagning. Dessutom öppnar programmet vita byta ljus controller.
7. I "motorn rörelse" fliken, klicka på "motorn på" och "husbil". När programvaran orienterar plattformen till utgångsläget, är vi redo att börja skriva in positioner för varje hjärtbladsnod.
8. I "motorn rörelse" fliken, välj den första plattan. Plattformen kommer att positionera i mitten av petriskålen under målet för mikroskop. Med hjälp av rörliga avståndet knappar, exakt position den första hjärtbladsnod för bildsamling. Med vitt ljus controller på, kan målregion följas via datorns bildskärm genom att slå på "live-läget" funktionen.
9. För första hjärtbladsnod, ställa in fokus och förstoring (1,6 x förstoring är att föredra) med den manuella rattarna på dissekera mikroskop. Fokus justeringar för återstående hjärtbladen på samma tallrik görs med tre lyftlänksväxlarna sitter under varje platta, på Robotics plattform.
10. När regionen av intresse har ställts in, klicka på "Lägg till den här positionen"-knappen. Programvaran kommer att lägga till koordinaterna för denna region till en position schema-fil och plattformen kommer att återvända till mitten av plattan.
11. Ställ positioner och fokusera på alla andra hjärtbladen på plåtar med hjälp av de rörliga avstånd knappar och manuell skruvar utjämning. Efter alla koordinater för alla hjärtbladen har matats in, spara koordinaterna positionen schemat.
12. Skriv in parametrarna bildsamling. I "bilden inställningen"-fliken väljer du vilken typ av ljus önskas, vit eller blå. För GFP upptäckt, bör endast den blå ljus användas. Ange också exponeringsinställningen. Även om vi kan ändra tiden för exponering självständigt för rött, blått och grönt, använder vi normalt samma inställningar för GFP foto-dokumentation (20, 14 och 14 sek för rött, grönt och blått kanaler, respektive) tillåter oss att göra direkt och konsekventa jämförelser mellan olika DNA-konstruktioner.
13. I samma "bild inställning" fliken anger en tom mapp där bilderna ska lagras. Varje serie bilder kommer att sparas i denna mästare mapp i fristående mappar, numrerade sekventiellt enligt den ordning Positionerna ingås för hjärtblad.
14. Gå till "fånga tiden kontroll"-fliken och ställ in bilden intervallet förvärvet tid och totalt antal cykler av bildsamling. Bilderna är oftast samlas varje timme för 100 timmar, vilket ger väldefinierade genuttrycksprofilerna.
15. Starta bild förvärv genom att klicka på "Kör schemat!" knappen i "position schemat"-fliken.
16. I slutet av 100 h bildsamlingen, överföra alla bilder från datorn som styr roboten till en stor kapacitet hårddisk eller dator för vidare bildanalys. Högupplösta bilder (1600 x 1200 pixlar) samlas som TIF-filer som mäter ~ 5 Mb vardera.

IV. Bildanalys

1. Montera 100 sekventiella bilder från varje mapp med hjälp av Adobe ImageReady.
   1. Öppna ImageReady och importera alla sekventiella bilder komponera en serie som ramar.
   2. Ändra storlek på originalbilder till 800 x 600 pixlar. Insamlade bilderna är högupplösta, som genererar stora filer som kan göra bildbehandling långsamt.
   3. Bläddra igenom bilderna och hitta en plats (er) synlig i de flesta bilder.
   4. Zoom upp till 300% på den valda platsen (s). Uppriktning av bilder med högre förstoring ger en mer exakt registrering.
   5. Sätt in ett lager ovanpå alla bilder och se är synlig i alla ramar. Markera plats (er) med hjälp av "pensel" verktyget.
   6. Påbörja anpassningen av alla ramar med "flytta" verktyg och ta märken på lagret som referens.
   7. När justeringen är klar, ta bort lagret används som referens och spara bilder som en enda "PSD" filen. Dessutom exporterar alla bildrutor som en enda "mov"-filen med den högsta upplösningen. Manuell anpassning av varje bild serien tar ~ 10 min.
2. Utför kvantifiering av genuttryck med ImageJ.
   1. Öppna ImageJ programvara och öppna "mov"-fil som sparats tidigare i ImageReady.
   2. Med hjälp av markeringsverktyget, välj en 400 x 300 pixel området och beskära bilden. Den nya filen ska sparas som en "avi"-fil.
   3. Separera sekventiella bilder, som ligger i den nya "avi"-fil i rött, blått och grönt kanaler genom att klicka på "bilden", "färg" och "RGB split" i ImageJ.
   4. Subtrahera bakgrundsfluorescens från alla bilder i grönt och rött kanaler. Använda den gröna kanalen bildserie, välj en 20 x 20 pixlar område från en region med icke-innehållande celler och spela in sin plats i "ROI Manager" verktyg, så att samma område kommer att väljas i båda kanalerna. Med 20 x 20 pixlar kvadrat aktiv i den gröna kanalen, gå till "plugins" kommandot som ligger i aktivitetsfältet i ImageJ och klicka sedan på "subtrahera mäts avkastningen för varje skiva" plugin-verktyg.
   5. I ImageJ, klicka på "Image", "Justera" och sedan "tröskel" för att definiera eller segment GFP-uttryckande pixlar. Justera tröskelvärden genom att dra fältet i tröskeln fönstret för att uppnå ett genomsnitt strålpunkt på 20-30 pixlar.
   6. Bestäm GFP uttryck med hjälp av en plugin som vi utformat för att mäta den genomsnittliga gråskala värde per pixel och det totala antalet GFP-uttryckande pixlar.
   7. Kopiera den genomsnittliga produktionen gråskala värden i ImageJ och klistra in i Microsoft Office Excel. Beräkna GFP uttryck för varje kanal (röd och grön) genom att multiplicera den genomsnittliga gråskala värde per pixel med det totala antalet av GFP-uttryckande pixlar för varje kanal. Summan av uttrycket värden för båda kanalerna ger GFP uttryck. Värden kan användas för att illustrera genuttrycksprofilerna och göra direkta jämförelser. Time-lapse animationer kan också genereras med "mov" eller "AVI"-filer, vilket ger en unik och tydlig visualisering av genuttryck profil.

V. representativa resultat

Den robotiserade bildsamlingen och analys (Fig. 1) redovisas här gör förvärv av en stor mängd kvantitativa data om genuttryck i en kort tidsperiod. För anläggning promotor karaktärisering med hjälp av GFP-genen är denna metod inte bara till nytta för att skapa övergående uttryck profiler (Fig. 2) men också för att spåra i detalj-sätt GFP uttryck i övergående och stabilt-transformerade plantvävnader ^5,6. Kort tidsförlopp animationer genereras med de insamlade sekventiella bilderna är ett värdefullt verktyg för djupgående analyser av genuttryck över tiden i plantvävnader. Denna metod har också stor ansökan att värdera faktorer som direkt påverkar genuttrycket. Till exempel har övergående GFP uttryck i förekomsten av olika förtrycker tysta viralt ursprung framgångsrikt studerats med hjälp av vår automatiserade image insamling och analys av system för ^7,8.

Figur 1. Bildanalys förfarande består av fyra huvudsakliga steg. (A) Förvärv av bildserie med hjälp av robotsystem bildsamlingen, (B) uppdelning av bilder i rött, blått och grönt-kanaler, (C) segmentering av uttrycka pixlar genom att justera gränsvärden och (D) få ut resultat innehåller gråskala värderingar och GFP-uttryckande fokus räkna.

Figur 2. Diagram som visar olika övergående uttryck profiler drivs av anläggningen initiativtagare smält till GFP. Data samlades in med hjälp av våra robotsystem bildsamlingen och analyseras med ImageReady och ImageJ programvara.

Discussion

Användningen av robotteknik har en enorm tillämpningar inom olika aspekter av mänskligt liv, specifikt har robotar som faktiskt används för att utföra aktiviteter i farliga miljöer, för att automatisera tråkiga och komplexa verksamheter, och att utföra uppgifter på ett mer exakt sätt. I molekylärbiologi, och specifikt gen analyser uttryck kan robotar hjälpa spåra inte bara drag av gener utan även vävnad tillväxt och utveckling över tiden. Många biologiska fenomen uppstår dynamiskt, vilket kan vara svårt att följa med enstaka observationer tidpunkt.

Användningen av GFP genen för uttryck studier innebär ytterligare fördelar för att observera vävnad respons och tillväxt. För vår experimentella procedurer, låter GFP oss följa genuttryck i samma bit vävnad över tiden GFP upptäckt är ett icke-förstörande. Dessutom är vår version av GFP-proteinet tillräckligt stabil för att upptäcka men också visar några omsättning för att minimera ansamling i växtvävnad, tillåter oss att följa både uppgång och fall av genuttryck.

Vi har redan utnyttjat våra robot bild insamling och analys för ett brett spektrum av applikationer. Vi ser stor potential för många biologiska applikationer där en dynamisk förståelse av ett fenomen önskas. Till exempel kan tillväxt och utveckling av växtvävnad spåras med hjälp av vårt system som ger värdefull kunskap / information om dessa processer. Även dynamiken i proteinet transporter med hjälp av reporter gener som GFP, kan enkelt visualiseras med time-lapse animationer. Den metod som beskrivs i denna rapport är tekniskt komplicerad, men konceptuellt enkel. Våra resultat är robusta och nya användningsområden ständigt upptäcks.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ	Software	National Institutes of Health		http://rsbweb.nih.gov/ij/