Summary
Biz giriş, izleme ve bitki hücrelerinde GFP ifade kantitatif analizi için bir yöntem raporu. Bu yöntem, zaman içinde, çok sayıda örneklerin yarı-sürekli bir resim koleksiyonu için özel olarak tasarlanmış bir robotik sistem kullanır. Ayrıca görüntü serisi analizi için ImageJ ve ImageReady kullanımını göstermek.
Abstract
Gen ifadesi, genellikle bitki dokularında bitki dokularında bileşiklerin yıkıcı ekstraksiyon çalışılmıştır.
Protocol
Aşağıdaki yöntem, otomatik bir görüntü toplama sistemi kullanılarak gen ekspresyonu görüntü analizi için bir protokol özetliyor. Açıklama kolaylığı için, genel yaklaşım dört adım bozuldu: 1) tohum hazırlama, 2) partikül bombardımanı, 3) robot resim koleksiyonu, ve 4) görüntü analizi kullanılarak gen giriş. Bu genel metodoloji diğer uygulamaların geniş bir aralığı için kullanılabilmesine rağmen, protokolleri mevcut setleri aynı parça izleme gen ekspresyonu için yararlı bir muhabir gen olan yeşil floresan proteininin (GFP) gen, kullanımı dayanmaktadır zaman içinde yaşayan doku.
I. Tohum Hazırlama
- Lima fasulyesi (Phaseolus lunatus cv Henderson-Bush) tohum satın ya da ideal bir büyüme odasında yetişen bitkiler (% 50 bağıl nem, 16 / 8 saat aydınlık: karanlık, 25/23 ° C gün / gece) hasat edilebilir. Hasat sonrası tohum kalitesi, -20 ° C'de depolama tohumları muhafaza edilebilir
- Tohumların çimlenme için Kırmızı GA7 kapları hazırlayın. Kapak filtre kağıdı veya kağıt havlu Kırmızı kutuları altındaki uygun. Kağıt havlu nemlendirin ve emilmeyen su dökmek için her konteyner ~ 25 ml deiyonize su ekleyin. Otoklav 20 dakika ıslatılmış kağıt içeren kutularda.
- 50 ml tek kullanımlık santrifüj tüpleri kullanarak, 60 rpm'de Konili çalkalayıcı sallayarak 20 dakika% 10'luk ticari çamaşır suyu çözeltisi (20-40 ml 20 tohum) tohumlar sterilize edin.
Not: sonraki adımları bir laminer akış kaputu yapılmalıdır. - 30 saniye süreyle yavaşça sallanarak her durulama sırasında steril deiyonize su ile tohum 4-7 kez durulayın.
- Her steril Kırmızı kutusunda bulunan katlanmış kağıt tabakaları arasında 5-6 kısır tohumlar yerleştirin.
- 4 gün boyunca 25 ° C, saat aydınlık 16 / 8:: koyu ve 40 μEm -2 s -1 aşağıdaki koşullar altında tohumları inkübe edin.
II. Partikül Bombardıman kullanarak Gen Giriş
- Gen yapıları ile favori canlı dokularda izlenebilir bir muhabir gen ekspresyon vektörü kullanarak oluşturun. Biz organizatörü ve organizatörü element analizleri için yüksek bir kopya sayısını ifade vektör yararlı mühendislik var. Bu vektör, GFP geninin promotör / dönüştürülmüş dokularda organizatörü elementi fonksiyonu görselleştirmek için kullanılan içerir .
- 1-2 civarındadır, fide çimlenme bombardımanı, tüketim lima fasulyesi kotiledonlarında önce saat ve tohum kat çıkarın. Bombardımanı için uygun kotiledonlarında sarı, yeşil, düz ve daha fazla görüntü analizi engel olabilecek herhangi bir hasar serbest ışık olmalıdır.
- OMS MS tuzları 1, B5 vitaminleri hemen eksize edildikten sonra 2,% 3 sakkaroz ve% 0.2 Gelrite (pH 5.7) içeren kültür ortamı yerleştirin kotiledonlarında.
- DNA M10 tungsten parçacıklar (Sylvania, Towanda, PA, USA) üzerine inşa çöktürün. 0.6 ml mikrofuge'de tüp, 25 ul tungsten parçacıklar (partiküller sağ kullanmadan önce steril su, 100 mg ml -1 yeniden süspanse), 5 ul DNA (1 mg ul -1), 25 ul 2.5 M, kalsiyum klorür ( Sigma -Aldrich Kedi C3881-500G) ve 10 ul 100 mM spermidin (Sigma Kedi S-2626). Vortex kısaca tüm bileşenleri iyice karıştırın.
- 5 dakika boyunca buz üzerinde DNA hazırlığı inkübe edin. Sonra, kaldırmak ve 50 ul süpernatant atın.
- Vorteks ile kaplı DNA parçacıkları yeniden süspanse edin ve hemen 2 ul kısım kaldırmak. Bu vorteks adım her zaman bir kısım tüp çıkarılır tekrarlayın. Buz Kaplı parçacıklar tutulur ve 15 dakika içinde kullanılmalıdır.
- Filtre ekranın ortasında top, yerden bir şırınga filtresi 2 ul kaplı partiküller. Partikül silah odasının içine filtre tutan birim kaplı partikül filtre ünitesi yerleştirin.
- Lima fasulyesi kotiledon adaxial tarafında bir siper üzerine yerleştirin ve partikül silah odasının baffle. Bir kabın dibine erimiş bir ekran oluşur baffle, bombardıman sırasında dokuları desteklemek için bir platform olarak kullanılır.
- Parçacık Gun (Bu metodoloji, biz laboratuarımızda tasarlanmış basit ve ucuz bir Partikül Girişlerinin Ülkelere Göre Silah 3, PIG,) kullanarak Bombard dokuların aşağıdaki gibidir; a) 'den sonra odanın tahliye için vakum giden vana, b) açık vakum parçacık bombardımanından sonra, vakum hattı vanasını kapatın ve egzoz vanası kullanarak vakum bırakın (30), 760 mm Hg, solenoid etkinleştirmek ve parçacıklar sevketmek için helyum serbest, c) ulaşır. Parçacıkları hızlandırmak için kullanılan helyum basıncı 50 PSI.
- Vakum yayımlandıktan sonra, bombardıman kotiledonlarında almak ve OMS kültür ortamı, kotiledon adaxial tarafına iade odasının kapısını açmak.
Not: kantifikasyon ve ifade profili için, biz genellikle üç kotiledonlarında her DNA oluşturmak için en az bombardıman. Genellikle bir DNA pozitif kontrol,iyi çalışılmış bir gen ekspresyon profil veren yapı, bir referans olarak yer almaktadır.
III. Otomatik Image Collection
- Cıva lambası açın ve ısınmak için lamba için 30 dakika bekleyin.
- Spot RT CCD kamera (Diagnostic Instruments Inc, Sterling Heights, MI, USA) ve robotik platformu hareket sürücüleri robotik platformu motor kontrol, güç kaynakları açın.
- MZFLIII diseksiyon mikroskobu (Leica, Heerbrugg, İsviçre); GFP algılama (Ex 480/40 nm, Em. GFP2 filtre seti 510 LP) için filtre seti.
- % 70 etanol ile püskürterek kalınlaşmış polikarbonat Petri kabı kapaklarını sterilize edin. Özel kapaklar, resim koleksiyonu 4 Petri kabı tabanı sırasında yoğuşmayı önlemek karşılamak için kullanılır.
- Otomatik görüntü toplama sisteminin robotik platformu (Arrick Robotik, Hurst, TX, ABD) bombardıman kotiledonlarında içeren tabak koyun. Robotik platformu bir step motor seti tarafından tahrik ve 8 Petri kutularına tutturulması için bir tablo oluşmaktadır. Bu platform, polikarbonat, polipropilen ve alüminyum inşa edilmiştir. Tabaklar, lateral plastik set-vida sıkma pozisyonda bağlanır.
- Robotik platformu ve görüntü elde etme hem de kontrol eden özel yazılım uygulamasını açın. Ayrıca, yazılım beyaz ışık kontrol anahtarı açın.
- "Motor hareket" sekmesinde, "Motor" ve "motor ev" tıklatın. Yazılım başlangıç konumuna platformu yönlendirir sonra, biz her kotiledon pozisyonları girmeye başlamak için hazırız.
- "Motor hareket" sekmesinde, ilk plaka seçin. Bu platform, mikroskop amacı altında Petri kabı merkezi yer alacak. Hareketli mesafe düğmelerini kullanarak, tam resim koleksiyonu için ilk kotiledon pozisyon. Beyaz ışık denetleyicisi ile, hedef bölge "canlı mode" özelliği çevirerek bilgisayar monitörü aracılığıyla gözlenebilir.
- Ilk kotiledon için diseksiyon mikroskobu manuel düğmeleri kullanarak odağı ve büyütme (1.6x büyütme tercih edilir) ayarlayın. Her plaka altında bulunan üç tesviye vidaları kullanarak robotik bir platform üzerinde, aynı plaka üzerinde kalan kotiledonlarında için odak ayarlamaları yapılır.
- Ilgi bölge edildikten sonra, "Bu pozisyonda ekle" düğmesini tıklatın. Yazılım, bir pozisyonda zamanlama dosyası bu bölgenin koordinatları katacak ve platform plaka merkezine geri dönecektir.
- Konumlarını ayarlayın ve hareketli mesafe düğmeleri ve manuel tesviye vidaları kullanarak plakalar üzerinde kalan tüm kotiledonlarında için odak. Kotiledonlarında tüm koordinatları girildikten sonra, pozisyon program koordinatları kaydedin.
- Resim koleksiyonu parametreleri girin. Beyaz ya da mavi "görüntü ayarı" sekmesinde, ışığın istenmediği türünü seçin. GFP tespiti için, sadece mavi ışık kullanılmalıdır. Ayrıca, pozlama ayarı girin. Biz bağımsız, kırmızı, mavi ve yeşil renk için maruz kalma zaman değiştirebilirsiniz olsa da, genellikle bizi doğrudan yapmak ve izin GFP foto-belgeler (20, 14 ve 14 sn sırasıyla kırmızı, yeşil ve mavi kanalları için) için aynı ayarları kullanabilirsiniz farklı DNA yapıları arasında tutarlı karşılaştırmalar.
- Aynı "görüntü ayarı" sekmesinde, boş bir klasöre görüntüler saklanabilir belirtin. Her dizi görüntüyü kotiledonlarında için girilen pozisyonların sırasına göre sıralı olarak numaralandırılmış, bağımsız klasörlerde bu ana klasör içinde saklanır.
- "Yakalama zaman kontrolü" sekmesine gidin ve görüntü elde etme zaman aralığı ve resim koleksiyonu döngüleri toplam sayısını ayarlamak. Görüntüler genellikle iyi tanımlanmış bir gen ekspresyon profilleri üreten, 100 saat boyunca her saat toplanır.
- Tıklayarak görüntü elde Başlat "programı çalıştırın!" "Konum programı" sekmesinde yer alan düğmesine basın.
- 100 saat görüntü toplama sonunda, daha fazla görüntü analizi için herhangi bir büyük kapasiteli sabit disk veya bilgisayar robotu kontrol eden bilgisayar tüm görüntüleri aktarabilirsiniz. Yüksek çözünürlüklü görüntüler (1600 x 1200 piksel) ~ 5 Mb her ölçüm TIF dosyalarını olarak toplanır.
IV. Görüntü Analizi
- Adobe ImageReady kullanarak her bir klasör 100 ardışık görüntüleri birleştirin.
- ImageReady açın ve ithal çerçeveler gibi bir dizi oluşturan tüm sıralı görüntüleri.
- 800 x 600 piksel orijinal görüntüleri yeniden boyutlandırma. Toplanan görüntüler, yüksek çözünürlüklü görüntü işleme yavaş yapabilir büyük dosyalar oluşturur.
- Görüntüleri ilerleyin ve çoğu görüntü görünür bir yerinde (ler) bulabilirsiniz.
- Seçilen nokta (lar)% 300 kadar yakınlaştırma. Daha kesin bir kayıt için daha yüksek büyütme kullanarak görüntüleri uyum sağlar.
- Tüm resimlerin üstüne bir katman ekleyin ve emin tüm çerçeveler içinde görünür yapmak. "Fırça" aracını kullanarak spot (ler) konumu işaretleyin.
- "Taşımak" aracını kullanarak tüm kareleri hizalayarak ve bir referans olarak katman işaretleri alarak başlayın.
- Hizalama tamamlandığında, bir referans olarak kullanılan katman silmek ve tek bir "PSD" dosya olarak görüntüleri kaydedebilirsiniz. Ayrıca, en yüksek çözünürlükte tek bir "mov" dosyası olarak tüm kareleri ihracat. Her resim serisi Manuel uyum ~ 10 dakika sürer.
- ImageJ kullanarak gen ekspresyonu ölçümü yapın.
- ImageJ yazılımı açın ve "mov" dosyasını açın ImageReady önceden kaydedilmiş.
- Seçim aracı kullanarak, 400 x 300 piksel alanı ve görüntü kırpma seçin. Bu yeni bir dosya, bir "avi" dosyası olarak kaydedilmesi gerekir.
- "Görüntü", "renk" ve ImageJ "RGB split" tıklayarak, kırmızı, mavi ve yeşil kanalları yeni "avi" dosyası bulunan sıralı resimler, ayırın.
- , Yeşil ve kırmızı kanallar tüm görüntüleri arka plan floresan çıkarma. Yeşil kanal görüntü serilerini kullanarak, 20 x 20 piksel alanı olmayan ifade hücreleri ile bir bölge seçin ve aynı bölgede, her iki kanal seçilecektir, böylece "ROI Yöneticisi" aracı konumunu kaydetmek. Yeşil kanal aktif 20 x 20 piksel kare ImageJ görev çubuğunda bulunan "plugins" komutuna gidin ve sonra plugin-aracı "her bir dilim için çıkarma ölçülen ROI" tıklayın.
- ImageJ, "eşik" GFP ifade piksel tanımlamak veya segment "ayarlamak", "Resim" üzerine tıklayın. Eşik seviyeleri ortalama 20-30 piksel bir nokta boyutu elde etmek için eşik penceresinde çubuğunu sürükleyerek ayarlayın.
- Piksel başına ortalama değeri ve toplam sayısı GFP ifade piksel gri tonlu ölçmek için tasarlanmış bir eklenti kullanarak GFP ifade belirleyin.
- Microsoft Office Excel içine ImageJ ve yapıştırma değerleri ortalama çıkış kopyalayın gri tonlama. Toplam sayısına göre ortalama çarpılarak her bir kanal için (kırmızı ve yeşil), GFP ifade hesaplayın piksel başına değeri gri tonlama GFP-Her kanal için piksel ifade. Her iki kanal için ifade değerleri toplamı, GFP bir ifade verir. Değerler gen ekspresyon profilleri göstermek ve doğrudan karşılaştırmalar yapmak için kullanılabilir. Time-lapse animasyonlar da eşsiz bir gen ekspresyon profili ve net bir görselleştirme sağlayarak, "mov" veya "avi" dosyaları kullanarak oluşturulabilir.
V. Temsilcisi Sonuçlar
Robot görüntü toplama ve analiz prosedürü (Şekil 1) gen ekspresyonu üzerine nicel veri kısa bir süre içinde büyük miktarda satın alma sağlar bildirdi. GFP geninin kullanarak bitki organizatörü karakterizasyonu için, bu yöntem sadece geçici ekspresyon profillerini (Şekil 2) oluşturmak için değil, aynı zamanda, geçici ve istikrarlı bir şekilde dönüştürülmüş bitki dokularında 5,6 detaylı bir şekilde GFP ifade izlemek için kullanışlı değildir . Kısa zaman atlamalı animasyonlar toplanan sıralı görüntüleri ile oluşturulan bitki dokularında zamanla gen ekspresyonu derinlemesine analizler için değerli bir araçtır. Bu metodoloji de gen ekspresyonu doğrudan etkileyen faktörleri değerlendirmek için harika bir uygulama vardır. Örneğin, geçici GFP ekspresyonu viral kökenli sessizliğini farklı bastırıcılarının varlığı altında başarılı bir şekilde otomatik görüntü toplama ve analiz sistemi 7,8 kullanılarak çalışıldı olmuştur.
Şekil 1. Görüntü analizi prosedürü dört temel aşamadan oluşmaktadır. (A) kullanarak görüntü serisi robotik görüntü toplama sistemi, (B) ayrılması, kırmızı, mavi ve yeşil kanalları görüntüleri, (C), eşik seviyeleri ayarlayarak ifade piksel segmentasyon, ve (D) çıktı sonuçlar elde Alımı içeren gri tonlama değerleri ve GFP ifade odak sayma.
Şekil 2, GFP için erimiş bitki rehberleri tarafından yönlendirilen farklı geçici ekspresyon profillerini gösteren Grafik . Veriler bizim robot görüntü toplama sistemi kullanılarak toplanan ve ImageReady ve ImageJ yazılım ile analiz edildi.
Discussion
Robot kullanımı, insan hayatının farklı yönlerini büyük uygulamalar vardır; özellikle, robotlar sıkıcı ve karmaşık faaliyetlerin etkin bir şekilde otomatikleştirmek için, ve daha hassas bir şekilde görevlerini yerine getirmek için, tehlikeli ortamlarda faaliyetlerini gerçekleştirmek için kullanılır olmuştur. Moleküler biyoloji, ve özellikle gen ekspresyon analizi, robotlar, genlerin sadece özellikleri değil, aynı zamanda zamanla doku büyüme ve gelişme izlemenize yardımcı olabilir. Birçok biyolojik olayların tek bir zaman noktasında gözlemlerini kullanarak takip etmek zor olabilir, dinamik olarak ortaya çıkar.
GFP geninin ekspresyon çalışmaları için kullanımı doku yanıtı ve büyüme gözlemlemek için ek avantajlar getiriyor. Deneysel prosedürleri için, GFP, GFP algılama tahribatsız olduğu gibi zaman içinde aynı doku parçası gen ekspresyonu takip sağlar. Ayrıca, GFP protein sürümü algılanmasına izin vermek için yeterince kararlı değil, aynı zamanda bize, yükseliş ve gen ekspresyonu düşüş takip etmesine, bitki dokularında birikmesi en aza indirmek için bazı ciro gösterir.
Biz zaten çok geniş bir uygulama yelpazesi için robot görüntü toplama ve analiz sistemi kullanılmaktadır var. Biz bir fenomen dinamik bir anlayış istenilen birçok biyolojik uygulamaları için yüksek potansiyeli öngörüyoruz. Örneğin, bitki dokularında büyüme ve gelişme, değerli bilgiler / bu süreçleri hakkında bilgi veren sistemi kullanılarak takip edilebilir. Ayrıca, GFP gibi muhabir genleri kullanarak protein taşıma dinamikleri, zaman atlamalı animasyonlar kullanarak kolayca görüntülenebilmekte olabilir. Bu raporda açıklanan yöntem, teknik, karmaşık ama kavramsal olarak basittir. Bizim sonuçlarımız sağlam ve sürekli yeni uygulamalar keşfedilmektedir.
Acknowledgments
Maaşlar ve araştırma desteği Amerika Birleşik Soya Kurulu tarafından sağlanan ve Eyalet ve Federal fonları tarafından Ohio State Üniversitesi / Ohio Tarımsal Araştırma ve Geliştirme Merkezi için tahsis edildi. Bu araştırma da kısmen CONACYT, Meksika, CMHG bir burs ile desteklenmiştir. Ticari marka veya tescilli ürünlerin Mansiyon OSU / OARDC ürünün garanti veya garanti teşkil etmez ve aynı zamanda uygun olabilir diğer ürünleri hariç olmak üzere onay anlamına gelmez. Dergi Makalesi yok HCS 09-17.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ | Software | National Institutes of Health | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15, 473-497 (1962).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res. 50, 150-158 (1968).
- Finer, J. J., Vain, P., Jones, M. W., McMullen, M. D. Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells. Plant Cell Rep. 11, 232-238 (1992).
- Finer, J. E., Finer, J. J. A simple method for reducing moisture condensation on Petri dish lids. Plant Cell Tiss Org. 91, 299-304 (2007).
- Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. Comparative analysis of 35S and Lectin promoters in transgenic soybean tissue using an automated image acquisition system and image analysis. Plant Cell Rep. 25, 290-296 (2006).
- Chiera, J. M., Bouchard, R. A., Dorsey, S. L., Park, E. H., Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. Isolation of two highly active soybean (Glycine max (L.) Merr.) promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system. Plant Cell Rep. 26, 1501-1509 (2007).
- Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. Quantification and extension of transient GFP expression by the co-introduction of a suppressor of silencing. Transgenic Res. 17, 1143-1154 (2008).
- Dhillon, T., Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. Quantitative evaluation of six different viral suppressors of silencing using image analysis of transient GFP expression. Plant Cell Rep. 28, 639-647 (2009).
