Summary
В этом видео мы продемонстрируем процедуру активации CD40 и расширение мышиных клеток из спленоцитов C57BL / 6 мышей, которые могут быть использованы в качестве модели антиген-представляющих клетки (АПК) для изучения индукции иммунитета.
Abstract
Исследование клеток показало, что CD40 активации улучшает их презентации антигена мощности. При стимуляции с интерлейкина-4 и CD40 лиганда (CD40L), человеческих клеток может быть расширена без трудностей из небольшого количества периферической крови в течение 14 дней до очень большого количества высоко-чистые CD40-лимфоцитов (> 10
Protocol
Протокол поколение мышиных CD40-активированных В-клеток (mCD40B) из спленоцитов делится на две части: часть демонстрирует подготовку мышиной CD40 лиганда (CD40L), выражающая HeLa клетки (tmuCD40L HeLa), который будет использоваться в качестве пластинчатых связаны фидерных клеток. Часть В описывает фактические мышиной CD40-B культуры.
А. Подготовка фидерных клеток (tmuCD40L HeLa)
TmuCD40L HeLa является сторонником человеческих эпителиальных клеточных линий, которые никогда не должны стать полностью вырожденная. Клетки, таким образом, разделил два раза в неделю. Культивирование в течение более 6 недель не рекомендуется.
- Удалить старые среды от первичной культуры с стерильной пипетки и мыть клетки с 10 мл 1x PBS. Аспирируйте PBS после мытья.
- Добавить 4 мл 1x трипсина / ЭДТА в 75 см 2 колбы в течение 10-15 минут при температуре 37 ° C. Используйте нежное нажмите, чтобы отделить клетки.
- Добавьте 10 мл дикий тип среды и поворота осторожно, чтобы остановить пищеварения трипсином.
- Передача клеточной суспензии в 50 мл трубки с стерильной пипетки и спина ячейки вниз на 265 мкг в течение 7 минут.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл дикий тип среды. Граф количества клеток аликвоту суспензии клеток и подготовить три 50 мл трубки с соответствующим количеством клеток:
- 2,5 х 10 6 клеток для субкультуры
- 0,4 х 10 6 клеток / лунку для облучения используется для мышиного CD40-B культуре клеток
- Остальная заморозить (при необходимости).
- Спиновые клетки вниз на 265 мкг в течение 7 минут.
- Удалить супернатант.
- Для субкультивирования: ресуспендирования 2,5 х 10 6 клеток в 10 мл выбор среды в 75 см 2 колбы культуры клеток (плотность клеток 2,5 х 10 5 клеток / мл) и инкубировать клетки при 37 ° C с 5% CO 2. Сплит клетки два раза в неделю.
- Для мышиного CD40-B культуре клеток: Вам нужно 2,4 х 10 6 клеток на один 6-луночный планшет. Ресуспендируют tmuCD40L клетках HeLa в дикий тип среды с плотностью 0,2 х 10 6 клеток / мл и облучать их на 78 Гр. Пластина 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку и инкубировать их при температуре 37 ° C с 5% CO 2. Используйте этот подготовленные пластины для В-клеток при стимуляции tmuCD40L HeLa клетки приверженцем (по крайней мере 4 часа: проверять соблюдение использованием микроскопа; не ждать более 24 ч до начала В-клеточной стимуляции). (Продолжить с Б.)
Б. мышей CD40-B культуре клеток
I. Подготовка спленоцитов для стимуляции CD40 (день 0):
Обратите внимание: перед тем как продолжить констатировать, что фидерных клеток являются приверженцем. Всегда добавляйте свежие решения мышиного интерлейкина-4, β-меркаптоэтанол и циклоспорин в питательную среду непосредственно перед употреблением.
- Рассеките селезенки C57BL / 6 мышей (гаплотип H-2b) и мыть дважды в 10-20 мл DMEM дополнен гентамицин [15μg/mL] путем переноса его с кончика пипетки 10 мл из одной галереи в другую. Избегайте передачи загрязняющих веществ (например, волосы) мыши. Фарш селезенки, пропуская ее через ячейки сетчатого фильтра (100 мкм) и промыть фильтр с еще 10 мл среды. Спином вниз спленоцитов в 265 мкг в течение 7 минут при комнатной температуре, ресуспендируют их в 7 мл muCD40-B клеточной среде, так и отдельные лимфоциты путем центрифугирования плотности Ficoll. Для этого слой клеток на 5 мл Mouse-Pancoll (предварительно нагретой при комнатной температуре) в 15 мл и трубки центрифуги при 450 мкг в течение 30 минут без тормоза при комнатной температуре.
- Слить большую часть верхнего слоя, оставляя нетронутой лимфоцитов слой на границе раздела. Передача лимфоцитов слой свежей 50 мл трубки, мыть один раз с 30 мл DMEM с гентамицин [15μg/mL] за счет остановки на 265 мкг в течение 7 минут, чтобы удалить другие клетки. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 10 мл mCD40-B средний стирки. Определить номер ячейки в аликвоту клеточной суспензии. Определить число клеток путем подсчета аликвоты клеточной суспензии.
- Спином вниз необходимое количество клеток в 265 мкг в течение 7 минут. Для 6-луночный планшет 5 х 10 6 клеток / лунку необходимо, таким образом, 30 х 10 6 клеток на чашку.
- Удалить супернатант и ресуспендируйте лимфоцитов на 1,25 х 10 6 клеток / мл в mCD40-B свежей питательной среды с добавлением 1 ЕД / мл интерлейкина-4 в качестве фактора роста, 100 мкМ β-меркаптоэтанол и 0,63 мкг / мл циклоспорин для предотвращения результатом Т-клеток (С учетом концентрации относятся к одной среды культуры мл!).
- Удалить супернатант из 6-луночный планшет предварительно инкубировали с клетками HeLa tmuCD40L.
- Аккуратно добавить 4 мл лимфоцитов подвески (1,25 х 10 6 клеток / мл) в каждую лунку 6-луночный планшет.
- Инкубируйте планшет при 37 ° C с 5% CO 2. На 3-й день reculture клеток (Продолжить с II.1.).
II. Субкультура клеток mCD40B (день 3, а затем два раза в неделю):
- Урожай mCD40B клетка кластера энергично пипетирования вверх и вниз с 10 мл пипетки и бассейном их в 50 мл трубки.
- Спином вниз на 265 мкг в течение 7 минут и полностью заменяют собой супернатант с mCD40-B средний стирки. При подсчете количества ячейки аликвоту, спина ячейки вниз на 265 мкг в течение 7 минут. Ресуспендируют mCD40B клеток в mCD40-B культуральной среде при концентрации 0,75 х 10 6 клеток / мл.
- Добавьте свежие решения мышиной интерлейкина-4 в концентрации 1 ЕД / мл, 100 мкМ β-меркаптоэтанол и 0,63 мкг / мл циклоспорина в среду.
- Удалить супернатант из 6-луночный планшет предварительно инкубировали с облученным tmuCD40L клетках HeLa.
- Аккуратно добавить 4 мл суспензии mCD40B ячейки (0,75 х 10 6 клеток / мл) в каждую лунку 6-луночный планшет.
- Инкубируйте пластин при 37 ° C с 5% CO 2.
- Снова субкультуры клетки каждые 3-4 дней, чтобы закончить с высокой чистоты мышиной CD40 активированных В-клеток после общей сложности 14 дней.
C. Устранение неисправностей: Что делать, если CD40-B клетки не растут?
- Проверяли ли Вы для CD40 лиганд выражение фидерных клеток?
- Являются ли пластинчатый питатель связаны клетки, используемые для стимуляции старше 24 часа?
- Есть ли загрязнение микоплазмой?
- Был интерлейкина-4 раствор, используемый для добавки свежей талой и сделал это есть соответствующее биологической активности?
- Был β-меркаптоэтанол и циклоспорин добавили в правильной концентрации?
На рисунке 1а.
На рисунке 1б.
Рис 1d.
Рисунок 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модификации данного протокола возможны, особенно в отношении происхождения CD40-стимул и тип мыши напряжение используется, также уступая в эффективной генерации мышиной CD40-активированных В-клеток. Ахмади соавт. показали аналогичные результаты для мышиных фибробластов, трансфицированных мышиной CD40-лиганд. В этом контексте презентации ксено-антиген может быть исключен с уверенностью, но интенсивные исследования в области безопасности и токсичности в естественных условиях не подавали признаков воспаления или автоматической реакции иммунитета в данной ситуации с использованием человеческих трансфицированных клеток HeLa. Тем не менее, лучшая альтернатива представляет растворимый мышиный CD40-лиганд с активацией и пролиферирующие активности, в то же время, что, насколько нам известно, не на коммерческой основе.
Этот протокол также работает для лимфоцитов у мышей 129S2/SvPas (гаплотип H-2b), но не был оценен для дальнейшего линий мышей до сих пор. Кроме различий в налаживании плотность клеток, цитокинов концентрации, продолжительности лечения циклоспорином, культуры клеток и блюда также могут привести к эффективным CD40-активации мышиных клеток с такой же скоростью распространения. Однако интенсивная работа была проведена по оптимизации этой системы максимально активации и пролиферации ставки в результате существующей системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эксперименты проводились в соответствии с национальными и европейскими рекомендации по поддержанию лабораторных животных. Что касается немецкого закона защиты животных животные находились под контролем регулярно соответствующие органы.
Acknowledgments
Мы любезно благодарит д-р Клеменс Wendtner за предоставление tmuCD40-лиганд-клеточной линии HeLa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| Hygromycin B, 0.2 mg/mL | |||
| 3. mCD40-B washing medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 4. mCD40-B culture medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| MEM, 0.1mM (1x) | |||
| FBS, 10% | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| RPMI 1640 | Invitrogen | REF 21875 | |
| D-MEM | Invitrogen | REF 41965 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| MEM NEAA | Invitrogen | REF 11140 | |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | Cat No P02-015 | |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
- Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
- Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
- von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
- Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
- Bergwelt-Baildon, M. S. von Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
- Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).
