Summary
In deze video, tonen we de procedure van de CD40-activatie en expansie van B-cellen van muizen splenocyten van C57BL / 6 muizen, die gebruikt kan worden als een model antigeen-presenterende cel (APC), de inductie van immuniteit bestuderen.
Abstract
Onderzoek naar de B-cellen heeft aangetoond dat CD40 activatie van hun antigeen presentatie vermogen verbetert. Wanneer gestimuleerd met interleukine-4 en CD40 ligand (CD40L), kunnen menselijke B-cellen worden uitgebreid zonder de moeilijkheden van kleine hoeveelheden van perifeer bloed binnen 14 dagen de tijd om zeer grote hoeveelheden van zeer zuivere CD40-B-cellen (> 10
Protocol
Het protocol voor het genereren van muizen CD40-geactiveerde B-cellen (mCD40B) van splenocyten is verdeeld in twee delen: deel A toont de bereiding van de muizen-CD40 ligand (CD40L) uitdrukken HeLa cellen (tmuCD40L HeLa), die zal worden gebruikt als plaat- gebonden feeder cellen. Deel B beschrijft de actuele muis CD40-B cultuur.
A. Bereiding van feeder-cellen (tmuCD40L HeLa)
De tmuCD40L HeLa is een aanhanger menselijke epitheel cellijn, die nooit zou moeten worden volledig confluent. De cellen zijn dan ook twee keer gesplitst per week. Het kweken van meer dan 6 weken wordt niet aanbevolen.
- Verwijder oude medium van de primaire cultuur met een steriele pipet en was cellen met 10 ml 1x PBS. Zuig het PBS na het wassen.
- Voeg 4 ml 1x trypsine / EDTA in een 75 cm 2 fles gedurende 10-15 minuten bij 37 ° C. Gebruik zachte tikken om de cellen los te maken.
- Voeg 10 ml van de wild-type medium en draai voorzichtig om de spijsvertering te stoppen met trypsine.
- Breng de celsuspensie in een 50 ml buis met een steriele pipet en de spin de cellen neer op 265 xg gedurende 7 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 10 ml van wild type medium. Tel het aantal cellen van een aliquot van de celsuspensie en voor te bereiden drie 50 ml buizen met het juiste aantal cellen:
- 2,5 x 10 6 cellen voor subcultuur
- 0,4 x 10 6 cellen / goed voor bestraling gebruikt voor de muis CD40-B-cel cultuur
- rest te bevriezen (indien nodig).
- Spin de cellen neer op 265 xg gedurende 7 minuten.
- Verwijder het supernatant.
- Voor subcultuur: resuspendeer 2,5 x 10 6 cellen in 10 ml selectie medium in een 75 cm 2 celkweek kolf (celdichtheid 2,5 x 10 5 cellen / ml) en incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO 2. Splits de cellen twee keer per week.
- Voor de muis CD40-B-cel cultuur: U moet 2,4 x 10 6 cellen voor een 6-wells plaat. Resuspendeer de tmuCD40L HeLa-cellen in wild type medium bij een dichtheid van 0,2 x 10 6 cellen / ml en bestralen ze op 78 Gy. Plaat 2 mL van de celsuspensie in elk putje en incubeer ze op 37 ° C met 5% CO 2. Gebruik deze voorbereid platen voor B-cel stimulatie bij tmuCD40L HeLa cellen aanhanger (minstens 4 uur: check hechting met behulp van de microscoop, wacht niet meer dan 24 uur tot B-cel stimulatie te starten). (Ga verder met B.)
B. muizen CD40-B-cel cultuur
I. Voorbereiding van splenocyten voor CD40-stimulatie (dag 0):
Let op: voordat u verder gaat vergewissen dat feeder cellen aanhanger zijn. Voeg altijd verse oplossingen van muriene interleukine-4, β-mercapto-ethanol en ciclosporine A aan het groeimedium onmiddellijk voor gebruik.
- Ontleden milt van C57BL / 6 muizen (haplotype H-2b) en tweemaal was het in 10-20 ml DMEM aangevuld met Gentamycine [15μg/mL] door de overdracht van het met een 10 ml pipet tip van een tube naar de andere. Voorkomen dat de overdracht van verontreinigingen (zoals haar) van de muis. Mince milt door het door een zeef cel (100 urn) en spoel filter met nog eens 10 ml medium. Spin down splenocyten op 265 xg gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur, opnieuw in suspensie ze in 7ml muCD40-B-cel medium, en een aparte lymfocyten door Ficoll dichtheid centrifugeren. Om dit te doen laag cellen op 5 ml Mouse-Pancoll (voorverwarmd op kamertemperatuur) in een 15 ml buis en centrifugeer bij 450 xg gedurende 30 min zonder rem bij kamertemperatuur.
- Teken het grootste deel van de bovenste laag, waardoor de lymfocyten laag ongestoord aan de interface. Overdracht lymfocyten laag op een verse 50 ml tube, een keer wassen met 30 ml DMEM met Gentamycine [15μg/mL] door te stoppen met draaien op 265 xg gedurende 7 minuten naar andere cellen te verwijderen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml mCD40-B wassen medium. Bepaal het aantal cellen in een hoeveelheid van de celsuspensie. Bepaal het aantal cellen door het tellen van een aliquot van de celsuspensie.
- Spin down de benodigde hoeveelheid van de cellen op 265 xg gedurende 7 minuten. Voor een 6-wells plaat 5 x 10 6 cellen / putje nodig zijn, dus 30 x 10 6 cellen per plaat.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de lymfocyten bij 1,25 x 10 6 cellen / ml in mCD40-B kweekmedium vers aangevuld met een U / mL van interleukine-4 als groeifactor, 100 uM β-mercapto-ethanol en 0,63 ug / ml ciclosporine A om te voorkomen dat uitgroei van T-cellen (gegeven concentraties verwijzen naar een ml kweekmedium!).
- Verwijder de bovenstaande vloeistof uit de 6-wells plaat pre-geïncubeerd met tmuCD40L HeLa-cellen.
- Voorzichtig Voeg 4 ml van de lymfocyt suspensie (1.25 x 10 6 cellen / ml) aan elk putje van de 6-wells plaat.
- Incubeer de plaat bij 37 ° C met 5% CO 2. Op dag 3 reculture de cellen (Ga verder met II.1.).
II. Subcultuur van mCD40B cellen (dag 3 en vervolgens twee keer per week):
- Oogst mCD40B cel cluster door krachtig en neer te pipetteren met een 10 ml pipet en het zwembad ze in een 50 ml buis.
- Spin neer op 265 xg gedurende 7 minuten en volledig de supernatant te vervangen door mCD40-B wassen medium. Terwijl het tellen van de cel hoeveelheid van een hoeveelheid, draai de cellen neer op 265 xg gedurende 7 minuten. Resuspendeer mCD40B cellen in mCD40-B kweekmedium bij een concentratie van 0,75 x 10 6 cellen / ml.
- Voeg verse oplossingen van muriene interleukine-4 in een concentratie van 1 U / ml, 100 uM β-mercapto-ethanol en 0,63 ug / ml ciclosporine A aan het medium.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof uit een 6-wells plaat vooraf geïncubeerd met bestraalde tmuCD40L HeLa-cellen.
- Voorzichtig Voeg 4 ml van de mCD40B celsuspensie (0,75 x 10 6 cellen / ml) aan elk putje van de 6-wells plaat.
- Incubeer de platen bij 37 ° C met 5% CO 2.
- Weer subcultuur van de cellen om de 3-4 dagen om te eindigen met een zeer zuivere murine CD40-geactiveerde B-cellen na een totaal van 14 dagen.
C. Trouble-shooting: Wat gebeurt er als CD40-B-cellen niet groeien?
- Heb je gecontroleerd of CD40 ligand expressie van feeder-cellen?
- Zijn de plaat-gebonden feeder cellen die worden gebruikt voor de stimulatie die ouder zijn dan 24 uur?
- Is er een besmetting met mycoplasma?
- Was de interleukine-4-oplossing voor de suppletie vers ontdooid en deed het over de juiste biologische activiteit?
- Was β-mercapto-ethanol en ciclosporine A toegevoegd in de juiste concentratie?
Figuur 1a.
Figuur 1b.
Figuur 1d.
Figuur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wijzigingen van dit protocol zijn mogelijk, vooral wat betreft de oorsprong van CD40-stimulus en het type muizenstam gebruikt, ook in waardoor een efficiënte generatie muizen CD40-geactiveerde B-cellen. Ahmadi et al.. hebben gelijkwaardige resultaten getoond voor muizen fibroblasten getransfecteerd met murine CD40-ligand. In deze context presentatie van xeno-antigeen kan met zekerheid worden uitgesloten, maar intensieve studies met betrekking tot de veiligheid en toxiciteit in vivo gaf geen tekenen van ontsteking of auto-immuniteit reactie in deze instelling met behulp van menselijke cellen getransfecteerd HeLa. Echter, het beste alternatief is een oplosbaar murine CD40-ligand met activerende en prolifererende activiteit op hetzelfde moment, dat is naar ons weten niet commercieel beschikbaar.
Dit protocol werkt ook voor lymfocyten uit 129S2/SvPas muizen (haplotype H-2b), maar is niet geëvalueerd voor een verdere muizenstammen tot nu toe. Bovendien verschillen in de aanpassing van de celdichtheid, cytokine concentratie, de duur van de cyclosporine A behandeling, kan media voor celkweek en gerechten ook leiden tot een efficiënte CD40-activatie van muizen B-cellen met dezelfde proliferatie tarieven. Er is echter intensief werken is besteed aan het optimaliseren van dit systeem het maximaliseren van activering en proliferatie tarieven resulterend in het huidige systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de nationale en Europese richtlijnen voor het houden van proefdieren. Verwijzing van de Duitse dierenwelzijnswet de dieren werden regelmatig gecontroleerd door de juiste instanties.
Acknowledgments
Wij danken dr. Clemens Wendtner voor het aanbieden van tmuCD40-Ligand-HeLa cellijn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| Hygromycin B, 0.2 mg/mL | |||
| 3. mCD40-B washing medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 4. mCD40-B culture medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| MEM, 0.1mM (1x) | |||
| FBS, 10% | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| RPMI 1640 | Invitrogen | REF 21875 | |
| D-MEM | Invitrogen | REF 41965 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| MEM NEAA | Invitrogen | REF 11140 | |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | Cat No P02-015 | |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
- Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
- Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
- von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
- Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
- Bergwelt-Baildon, M. S. von Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
- Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).
