Summary
Bu video, CD40 aktivasyonu ve dokunulmazlık indüksiyonu eğitim için bir model antijen sunan hücre (APC) olarak da kullanılabilir C57BL / 6 farelerin dalak, fare B hücreleri genişleme prosedürü göstermektedir.
Abstract
B hücreleri üzerinde araştırma CD40 aktivasyonu ve antijen sunumu kapasitesi iyileştirdiğini göstermiştir. Interlökin-4 ve CD40 ligand (CD40L) ile uyarıldığında, insan B hücreleri, 14 gün içinde son derece saf CD40-B hücreleri (çok büyük miktarda küçük miktarlarda periferik kan zorluklar olmadan açılabilir> 10
Protocol
Splenositlerin fare CD40 aktive B hücreleri (mCD40B) üretimi için protokol iki bölüme ayrılmıştır: Kısım A olarak kullanılacak plaka HeLa hücreleri (tmuCD40L HeLa), ifade fare CD40 ligand (CD40L) hazırlanmasında gösteriyor. besleyici hücreler bağlı. Bölüm B, gerçek bir fare CD40-B kültür açıklar.
A. besleyici hücreler Hazırlama (tmuCD40L HeLa)
TmuCD40L HeLa tamamen konfluent haline asla yapışık bir insan epitel hücre hattı,. Hücreler bu nedenle haftada iki kez parçalı. Daha fazla 6 hafta içinde Kültürleme tavsiye edilmez.
- Steril bir pipet ile primer kültür eski orta çıkarın ve 10 ml 1x PBS ile yıkayın hücreleri. PBS ile yıkandıktan sonra aspire.
- 37, 10-15 dakika için 75 cm 2 balon 4 ml 1x tripsin / EDTA ekleyin ° C. Hücreleri ayırmak için hafif dokunarak kullanın.
- Vahşi tip orta 10 ml ekleyin ve tripsin ile sindirim durdurmak için yavaşça dönebilen.
- Hücre süspansiyonu steril bir pipet yardımıyla 50 ml tüp içine aktarın ve 7 dakika boyunca 265 xg'de hücreleri aşağı döndürün.
- Süpernatantı ve vahşi tip orta 10 ml hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Hücre süspansiyonu bir kısım hücre sayısı sayın ve uygun sayıda hücre ile üç 50 ml tüpler hazırlamak:
- Altkültürün 2.5 x 10 6 hücre
- Fare CD40 B hücre kültürü için kullanılan / iyi ışınlanması için 0.4 x 10 6 hücre
- dondurmak için geri kalan (gerekirse).
- 7 dakika boyunca 265 xg'de hücreleri aşağı spin.
- Süpernatantı.
- Alt kültüre için tekrar süspansiyon 2.5 ° C ile% 5 CO 2 75 cm 2 hücre kültürü şişesi 10 ml seçim ortamda (hücre yoğunluğu 2.5 x 10 5 hücre / ml) ve 37 hücreler inkübasyon x 10 6 hücre. Haftada iki kez hücreleri bölün.
- Fare CD40 B hücre kültürü için bir adet 6-plaka için 2,4 x 10 6 hücre gerekir. 0.2 x 10 6 hücre / mL yoğunluğu vahşi tip orta tmuCD40L HeLa hücreleri yeniden süspanse edin ve 78 Gy ışın tedavisi. Yanı sıra, her 37 ° inkübe ° C ile% 5 CO 2 hücre süspansiyonu Plaka 2 mL. TmuCD40L HeLa hücrelerinde yapışık B-hücre uyarılması için hazırlanmış tabak kullanın (en az 4 saat: mikroskop kullanarak bağlılık kontrol edin; B-hücre stimülasyon başlatmak için 24 saat daha beklemek gerekmez). (B. devam)
B. murin CD40 B hücre kültürü
CD40 stimülasyon (gün 0) splenositlerin I. Hazırlık:
Lütfen dikkat: besleyici hücreler yapışık olduğu tespit devam etmeden önce. Her zaman fare interlökin-4, β-mercaptoethanol ve büyüme ortamına siklosporin, kullanımdan hemen önce taze çözümler ekleyin.
- C57BL / 6 farelerinde (H-2b haplotip), dalak inceleyin ve 10-20 ml DMEM iki kez yıkayın, başka bir tüp 10ml pipet ile transfer Gentamisin [15μg/mL] ile desteklenmiş. Fare transfer kirleticiler (örneğin saç) kaçının. (100μm) bir hücre süzgecinden geçirilerek dalak Kıyma ve orta başka bir 10 mL süzgeç durulayın. Oda sıcaklığında 7 dakika süreyle 265 xg'de splenositlerin Spin, 7ml muCD40-B hücre, orta ve Ficoll yoğunluğu santrifüj ayrı lenfositlerin tekrar süspansiyon haline getirin. 5 ml, 30 dakika için 450 xg'de 15 mL tüp ve santrifüj Fare-Pancoll (oda sıcaklığında önceden ısıtılmış) tabakası hücreleri oda sıcaklığında frensiz yapmak için.
- Arayüzü rahatsız lenfosit tabakası bırakarak, en üst katmanı çizin. Taze bir 50 ml tüp lenfosit katmanı Transferi, diğer hücreleri çıkarmak için 7 dakika süreyle 265 xg'de aşağı iplik Gentamisin [15μg/mL] ile 30ml DMEM ile bir kez yıkayın. Süpernatantı atın ve mCD40-B yıkama orta 10 ml hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Hücre süspansiyonu bir kısım hücre sayısını belirler. Hücre süspansiyonu bir kısım sayarak hücre sayısını belirler.
- 7 dakika boyunca 265 xg'de gerekli miktarda hücre aşağı spin. 6-iyi bir plaka için 5 x 10 6 hücre / kuyu, böylece plaka başına 30 x 10 6 hücre ihtiyaç vardır.
- Süpernatantı ve büyüme faktörü olarak, siklosporin 100 mcM β-mercaptoethanol ve 0.63 mcg / ml önlemek için 1.25 x 10 6 hücre / ml taze interlökin-4 1 U / ml ile desteklenmiş mCD40-B kültür ortamı lenfositlerin tekrar süspansiyon T-hücrelerinin akıbet (Verilen konsantrasyonları bir ml kültür ortamı bakın!).
- 6 plaka tmuCD40L HeLa hücreleri ile ön inkübasyona süpernatantı.
- 6 plaka her bir kuyu için 4 ml (1.25 x 10 6 hücre / ml) lenfosit süspansiyonu yavaşça ekleyin.
- 37 ° ° C,% 5 CO 2 plaka inkübe . 3. günde hücreleri (II.1 ile devam edin.) Reculture.
II. MCD40B hücreleri (3. gün ve daha sonra haftada iki kez) altkültürünün:
- 50 ml tüp içine 10 ml pipet ve havuz onları şiddetle yukarı ve aşağı pipetleme Hasat mCD40B hücre kümesi.
- 7 dakika boyunca 265 xg'de Spin ve süpernatant tamamen mCD40-B yıkama orta yerine. Bir kısım hücre miktarını sayma, 7 dakika boyunca 265 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün. 0.75 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon mCD40-B kültür ortamında süspanse edin mCD40B hücreleri.
- 1 U / ml, 100 mcM β-mercaptoethanol ve orta siklosporin 0.63 mcg / ml 'lik bir konsantrasyon interlökin-4 fare taze çözümler ekleyin.
- 6 plaka ışınlanmış tmuCD40L HeLa hücreleri önceden inkübe süpernatantı.
- 6 plaka her iyi mCD40B hücre süspansiyonu (0.75 x 10 6 hücre / ml) 4 mL yavaşça ekleyin.
- 37 ° plakaları inkübe ° C,% 5 CO 2 .
- Yine her 3-4 günde bir toplam 14 gün sonra yüksek saflıkta fare CD40 aktive B hücreleri ile sonuna kadar hücreleri altkültürü.
C. Sorun Giderme: CD40-B hücreleri büyümek ne olur değil mi?
- Besleyici hücreler CD40 ligand ifade için kontrol ettiniz?
- 24 saat daha eski uyarılması için kullanılan plaka bağlı besleyici hücreler musunuz?
- Mycoplasma ile bir kirlenme var mı?
- Takviyesi için kullanılan interlökin-4 çözüm taze çözülmüş ve uygun biyolojik aktivite var mı?
- Β-mercaptoethanol ve siklosporin A doğru konsantrasyon eklendi?
Şekil 1a.
Şekil 1b.
Şekil 1d.
Şekil 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolün, özellikle de verimli nesil fare CD40-aktive B hücreleri verimli CD40-uyarıcı ve kullanılan fare gerginlik türü, kökeni ile ilgili Değişiklikler mümkündür. Ahmedi et al. CD40 ligand fare ile transfekte fare fibroblastlar için benzer sonuçlar vermiştir. Xeno-antijen Bu bağlamda sunumda kesin olarak hariç, ama güvenlik ve in vivo toksisite ile ilgili yoğun çalışmalar insan transfekte HeLa hücreleri kullanarak bu ayarı inflamasyon veya oto-bağışıklık reaksiyonu için hiçbir belirti verdi olabilir . Ancak, en iyi alternatif, bildiğimiz kadarıyla piyasada mevcut değil, aynı zamanda, faaliyet aktive ve prolifere CD40 ligand çözünen bir fare temsil eder.
Bu protokol aynı zamanda 129S2/SvPas fareler (haplotype H-2b) lenfositleri için çalışır, ancak şimdiye kadar, daha fazla fare suşları için henüz değerlendirilmemiştir. Ayrıca hücre yoğunluğu ayarı farklılıkları, sitokin konsantrasyonu, süresi siklosporin A tedavisi, hücre kültürü medya ve yemekleri de benzer çoğalması oranları ile fare B hücreleri verimli CD40 etkinleştirme yol açabilir. Ancak, yoğun çalışma, mevcut sistem aktivasyonu ve çoğalması oranlarını maksimize bu sistem optimize harcanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Deneylerde laboratuar hayvanları tutmak için ulusal ve Avrupa kurallarına uygun olarak yapıldı. Alman hayvan refahı hukuk değinen hayvanların uygun yetkililer tarafından düzenli olarak kontrol altına alındı.
Acknowledgments
Biz lütfen Dr. Clemens Wendtner tmuCD40 Ligandla HeLa hücre hattı sağlamak için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| Hygromycin B, 0.2 mg/mL | |||
| 3. mCD40-B washing medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 4. mCD40-B culture medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| MEM, 0.1mM (1x) | |||
| FBS, 10% | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| RPMI 1640 | Invitrogen | REF 21875 | |
| D-MEM | Invitrogen | REF 41965 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| MEM NEAA | Invitrogen | REF 11140 | |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | Cat No P02-015 | |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
- Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
- Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
- von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
- Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
- Bergwelt-Baildon, M. S. von Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
- Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).
