Summary
I denna video visar vi förfarandet för CD40-aktivering och expansion av murina B-celler från splenocytes av C57BL / 6 möss, som kan användas som en modell antigen-presenterande celler (APC) att studera induktion av immunitet.
Abstract
Forskning om B-celler har visat att CD40 aktivering förbättrar deras kapacitet antigen presentation. När stimuleras med interleukin-4 och CD40 ligand (CD40L) kan mänskliga B-celler utökas utan svårigheter från små mängder av perifert blod inom 14 dagar till mycket stora mängder högt ren CD40-B-celler (> 10
Protocol
Protokollet för generering av murina CD40-aktiverade B-celler (mCD40B) från splenocytes är uppdelad i två delar: Del A visar att förbereda murina CD40 ligand (CD40L) som uttrycker HeLa celler (tmuCD40L HeLa), som kommer att användas som plåt- bundet feeder celler. Del B beskriver det faktiska murin CD40-B-kultur.
A. Beredning av feeder celler (tmuCD40L HeLa)
Den tmuCD40L HeLa är en anhängare mänskliga epitelceller linje, som aldrig skulle bli helt sammanhängande. Cellerna är därför uppdelad två gånger i veckan. Odling över mer än 6 veckor rekommenderas inte.
- Ta bort gammalt medium från den primära kulturen med en steril pipett och tvätta cellerna med 10 ml 1X PBS. Aspirera PBS efter tvätt.
- Tillsätt 4 ml 1X Trypsin / EDTA i en 75 cm 2-kolv i 10-15 minuter vid 37 ° C. Använd försiktigt packas ihop för att lossa cellerna.
- Tillsätt 10 ml av vildtyp medium och vridbar försiktigt för att stoppa matsmältning med trypsin.
- Överför cellsuspension i ett 50 ml rör med en steril pipett och snurra celler nedåt vid 265 xg under 7 minuter.
- Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten i 10 ml vildtyp medium. Räkna cellen antalet en delmängd av cellsuspensionen och förbereda tre 50 ml rör med lämpligt antal celler:
- 2,5 x 10 6 celler för subkulturen
- 0,4 x 10 6 celler / brunn för bestrålning används för murin CD40-B-cellodling
- Återstår att frysa (om det behövs).
- Snurra cellerna nere vid 265 xg under 7 minuter.
- Avlägsna supernatanten.
- För subkulturodling: resuspendera 2,5 x 10 6 celler i 10 ml valet medium i en 75 cm 2 cellkultur kolv (celltäthet 2,5 x 10 5 celler / ml) och inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO 2. Dela cellerna två gånger per vecka.
- För murina CD40-B-cellodling: Du behöver 2,4 x 10 6 celler för en 6-brunnar. Resuspendera tmuCD40L HeLa cellerna i vildtyp medium vid en densitet på 0,2 x 10 6 celler / ml och bestråla dem på 78 Gy. Plate 2 mL av cellsuspensionen i varje brunn och inkubera dem vid 37 ° C med 5% CO 2. Använd detta beredd plattor för B-cells stimulering när tmuCD40L HeLa celler anhängare (minst 4 timmar: kontrollera efterlevnaden med hjälp av mikroskop, vänta inte mer än 24 timmar att starta B-cells stimulering). (Fortsätt med B.)
B. Murine CD40-B-cellodling
I. Förberedelse av splenocytes för CD40-stimulering (dag 0):
Observera: innan du fortsätter säkerställa att feeder celler anhängare. Tillsätt alltid färska lösningar av murina interleukin-4, β-Mercaptoethanol och cyklosporin A till odlingsmedium omedelbart före användning.
- Dissekera mjälten från C57BL / 6 möss (haplotyp H-2b) och tvätta den två gånger i 10-20 ml DMEM kompletteras med Gentamycin [15μg/mL] genom att överföra den med en 10 ml pipett tips från en tub till en annan. Undvika att överföra föroreningar (t.ex. hår) för musen. Mal mjälte genom passering genom en cell sil (100μm) och skölj sil med en annan 10 ml medium. Spinn ner splenocytes vid 265 xg under 7 minuter i rumstemperatur, återsuspendera dem i 7ml muCD40-B-cell medium, och separat lymfocyter genom Ficoll täthet centrifugering. För att göra det lagret celler på 5 ml Mouse-Pancoll (uppvärmt vid rumstemperatur) i ett 15 ml rör och centrifugera vid 450 xg under 30 min utan broms vid rumstemperatur.
- Tappa av det mesta av det övre skiktet medan den lymfocyter lagret ostört i gränsområdet. Överföring lymfocyter lager till en ny 50 ml tub, tvätta en gång med 30ml DMEM med Gentamycin [15μg/mL] genom att snurra ner vid 265 xg under 7 minuter för att ta bort andra celler. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i 10 ml mCD40-B tvätt medium. Bestäm mobilnummer i en delmängd av cellsuspensionen. Bestäm mobilnummer genom att räkna en delmängd av cellsuspensionen.
- Spinn ner önskad mängd celler vid 265 xg under 7 minuter. För en 6-brunnar 5 x 10 6 celler / brunn behövs, alltså 30 x 10 6 celler per platta.
- Avlägsna supernatanten och suspendera lymfocyter vid 1,25 x 10 6 celler / ml i mCD40-B odlingsmedium nyligen kompletterats med ett U / mL av interleukin-4 som tillväxtfaktor, 100 mikroM β-Mercaptoethanol och 0,63 mikrogram / ml ciklosporin A för att förhindra utväxt av T-celler (koncentrationer som anges hänvisar till en mL odlingsmedium!).
- Avlägsna supernatanten från 6-brunnar före inkuberas med tmuCD40L HeLa celler.
- Försiktigt Tillsätt 4 ml av lymfocyter fjädring (1,25 x 10 6 celler / ml) till varje brunn på 6-brunnar.
- Inkubera plattan vid 37 ° C med 5% CO 2. På dag 3 reculture cellerna (Fortsätt med II.1.).
II. Subkultur av mCD40B celler (dag 3 och sedan två gånger i veckan):
- Harvest mCD40B cell kluster av kraftigt pipettera upp och ned med en 10 ml pipett och sammanföra dem i ett 50 ml rör.
- Spin ner vid 265 xg under 7 minuter och helt ersätta supernatanten med mCD40-B tvätt medium. Samtidigt räknar cellen värdet på en alikvot, snurra cellerna nere vid 265 xg under 7 minuter. Resuspendera mCD40B cellerna i mCD40-B odlingsmedium vid en koncentration på 0,75 x 10 6 celler / ml.
- Lägg till nya lösningar av murina interleukin-4 i en koncentration av 1 U / ml, 100 mikroM β-Mercaptoethanol och 0,63 mikrogram / ml ciklosporin A till mediet.
- Avlägsna supernatanten från en 6-brunnar före inkuberas med bestrålade tmuCD40L HeLa celler.
- Försiktigt Tillsätt 4 ml av den mCD40B cellsuspension (0,75 x 10 6 celler / ml) till varje brunn på 6-brunnar.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C med 5% CO 2.
- Återigen subkultur cellerna var 3-4 dagar för att sluta med mycket ren murin CD40-aktiverade B-celler efter sammanlagt 14 dagar.
C. Felsökning: Vad händer om CD40-B-celler inte växa?
- Har du kollat för CD40 ligand uttrycket av feeder celler?
- Är plattan bundna feeder celler som används för att stimulera äldre än 24 h?
- Finns det en förorening med mykoplasma?
- Var interleukin-4-lösning används för komplettering tinade nyligen och gjorde det ha lämplig biologisk aktivitet?
- Var β-Mercaptoethanol och cyklosporin A läggas i rätt koncentration?
Figur 1a.
Figur 1b.
Figur 1d.
Figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ändringar av detta protokoll är möjliga, särskilt när det gäller ursprunget till CD40-stimulans och vilken typ av mus stam som används, även ger en effektiv generering av murina CD40-aktiverade B-celler. Ahmadi et al. har visat liknande resultat för musfibroblaster transfererats med murina CD40-ligand. I detta sammanhang presentation av xeno-antigen kan uteslutas med säkerhet, men intensiva studier avseende säkerhet och toxicitet in vivo gav inga tecken på inflammation eller autoimmunitet reaktion i denna inställning med humana transfekterade HeLa celler. Däremot representerar det bästa alternativet ett lösligt murin CD40-ligand med aktiverande och prolifererande aktivitet samtidigt, vilket är att vår kunskap inte är kommersiellt tillgänglig.
Detta protokoll fungerar även för lymfocyter från 129S2/SvPas möss (haplotyp H-2b), men har inte utvärderats för ytterligare musstammar hittills. Vidare skillnader i inställning av celltäthet, cytokin koncentration, längd cyklosporin A behandling kan cellodling media och rätter leder också till en effektiv CD40-aktivering av murina B-celler med liknande spridning priser. Dock har ett intensivt arbete lagts ned på att optimera systemet maximera aktivering och priser spridning resulterar i det nuvarande systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Experimenten utfördes i enlighet med den nationella och europeiska riktlinjer för försöksdjur hålla. Hänvisa den tyska lagen djurskydd djuren kontrolleras regelbundet av behöriga myndigheter.
Acknowledgments
Vi tackar vänligt Dr Clemens Wendtner för att ge tmuCD40-ligand-HeLa cellinje.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| Hygromycin B, 0.2 mg/mL | |||
| 3. mCD40-B washing medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 4. mCD40-B culture medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| MEM, 0.1mM (1x) | |||
| FBS, 10% | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| RPMI 1640 | Invitrogen | REF 21875 | |
| D-MEM | Invitrogen | REF 41965 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| MEM NEAA | Invitrogen | REF 11140 | |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | Cat No P02-015 | |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
- Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
- Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
- von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
- Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
- Bergwelt-Baildon, M. S. von Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
- Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).
