Summary
在这个视频中，我们展示的CD40从C57BL / 6小鼠的脾细胞，它可以用来作为模型抗原提呈细胞（APC）的研究免疫诱导小鼠的B细胞的活化和扩大的过程。
Abstract
有研究表明，B细胞CD40的激活提高其抗原提呈能力。当白细胞介素4和CD40配体（CD40L）的刺激下，没有非常大量高纯度的CD40 - B细胞（14天之内的困难，从少量外周血的可扩展人类B细胞> 10
Protocol
协议分为两个部分：第一部分为一代小鼠CD40激活的B细胞（脾mCD40B）一个演示小鼠CD40配体（CD40L）表达HeLa细胞（tmuCD40L HeLa细胞），这将被用作板准备束缚饲养层细胞。 B部分介绍了实际的小鼠CD40 - B的文化。
A.制备饲养细胞（HeLa细胞tmuCD40L）
tmuCD40L HeLa细胞是一个附着的人类上皮细胞系，这不应该成为完全融合。因此，这些细胞被劈裂每周两次。超过6周以上的培养，不推荐。
- 从小学文化的老媒体取出，用无菌吸管和10 mL 1X PBS中洗细胞。吸的PBS洗涤后。
- 添加4毫升1X胰蛋白酶/ EDTA，在一个75厘米的 2瓶10-15分钟，在37 ° C。使用温柔攻分离的细胞。
- 野生型中添加10毫升，并轻轻旋转停止用胰酶消化。
- 转移到50 mL试管细胞悬液，用无菌吸管和旋转265 7分钟XG的细胞。
- 去除上清，重悬细胞沉淀在野生型中的10毫升。计数细胞悬液等分的细胞数，并准备适当数量的细胞50毫升管：
- 2.5 × 10 6细胞对亚文化
- 0.4 × 10 6细胞/孔照射小鼠CD40 - B细胞培养使用
- 其余冻结（如需要）。
- 旋转细胞在265 7分钟XG。
- 去除上清。
- 传代培养：重悬于2.5 × 10 6细胞10毫升，75厘米2细胞培养瓶中的选择培养基（细胞密度为2.5 × 10 5细胞/ mL）孵育细胞在37℃，5％的CO 2 。每周两次分裂的细胞。
- 对于小鼠CD40 - B细胞文化：您需要2.4 × 10 6 6孔板细胞。在野生型中重悬tmuCD40L HeLa细胞密度0.2 × 10 6细胞/ mL，他们在78 Gy的照射。板2毫升细胞悬液，每口井，并在37℃，5％的CO 2。使用B -细胞的刺激，这准备板块tmuCD40L HeLa细胞是贴壁时（至少4个小时：用显微镜检查坚持;不要等到超过24 h开始的B细胞刺激）。 （继续与B）
B.小鼠CD40 - B细胞培养
一，制备脾细胞CD40的刺激（0天）：
请注意：在继续之前确定，饲养层细胞是贴壁。随时添加新的解决办法小鼠白细胞介素- 4，β-巯基乙醇和环孢素A的生长介质，使用前。
- 剖析的C57BL / 6小鼠（H - 2B单体）的脾和10-20毫升的DMEM洗两次辅以庆大霉素[15μg/mL]一个10毫升吸管尖从一个管到另一个传输。避免使用鼠标的传输污染物（例如头发）。切碎脾细胞通过一个过滤器（100微米）通过，并与其他10毫升的中型冲洗过滤器。降速在室温下为7分钟在265 XG脾，重悬在7ML muCD40 - B细胞中，并Ficoll密度离心分离淋巴细胞。没有在室温下刹车，这样做的5毫升鼠标Pancoll（在室温预热）在15毫升管和离心30分钟XG 450层细胞。
- 绘制关闭最上层，离开淋巴细胞在界面层不受干扰。淋巴细胞层转移到一个新的50 mL试管中，用30毫升，庆大霉素[15μg/mL] DMEM培养液一旦被旋转265 7分钟XG删除其他细胞。弃上清，重悬细胞mCD40 - B的清洗介质在10毫升的。确定细胞的细胞悬液分装数。确定由计数的细胞悬液等分细胞数。
- 离心7分钟在265 XG的细胞所需的金额。对于6孔板5 × 10 6细胞/孔的需要，因此30 × 10 6细胞每盘。
- 取出上清液，重悬mCD40 - B的文化与1 U /白细胞介素4毫升新鲜培养基中的淋巴细胞，在1.25 × 10 6细胞/ mL，生长因子，100微米，β-巯基乙醇和0.63微克/毫升，环孢素A，以防止T细胞的生长（由于浓度是指一毫升培养液！）。
- 取出从6孔板与tmuCD40L HeLa细胞预孵育中的上清。
- 轻轻地添加4毫升的淋巴细胞悬液（1.25 × 10 6细胞/ mL）以及每6孔板。
- 板在37℃，5％的CO 2。 第3天reculture细胞（二.1继续）。
二。 mCD40B细胞传代培养的（第3天，然后每周两次）：
- 收获mCD40B大力移液10毫升到50毫升管的移液器和池他们向上和向下的细胞群。
- 离心7分钟在265 XG，并完全取代mCD40 - B的清洗介质的上清。虽然计数细胞数量的等分，旋转265 XG细胞为7分钟。 mCD40B悬浮细胞mCD40 - B的培养基中，在0.75 × 10 6细胞/ ml的浓度。
- 小鼠白细胞介素4的新鲜的解决方案中添加一个1 U /毫升，100μMβ-巯基乙醇和0.63μg/ mL的中期环孢素A的浓度。
- 取出从6孔板与照射tmuCD40L HeLa细胞预孵育中的上清。
- 轻轻地添加4毫升每6孔板以及mCD40B细胞悬液（0.75 × 10 6细胞/ mL）。
- 孵育板在37℃，5％的CO 2。
- 再次传代培养的细胞，每隔3-4天，以高纯度的小鼠CD40的B细胞激活后的14天总。
C.故障排除：CD40的B细胞，如果不长呢？
- 你有检查饲养层细胞的CD40的配体表达？
- 板约束馈线用于刺激超过24h以上的细胞？
- 是否有支原体污染吗？
- 是白细胞介素- 4解决方案，为补充新鲜解冻，并有相应的生物活性？
- 是β-巯基乙醇和环孢素A中添加正确的浓度？
图1a。
图1b。
图1d。
图2。
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Discussion
本协议的修改是可能的，尤其是关于CD40的刺激和使用的小鼠品系类型的起源，也高产高效代小鼠CD40激活的B细胞。艾哈迈迪等人。表明小鼠CD40的配体转染小鼠成纤维细胞类似的结果。可以肯定地排除在这种异种抗原的背景下演示，但在体内的安全性和毒性的深入研究了在此设置使用人类转染的HeLa细胞的炎症或自身免疫反应的迹象。然而，最好的替代代表与激活和增殖活动在同一时间，这是我们的知识不是市售的可溶性小鼠CD40的配体。
该协议也适用于129S2/SvPas小鼠（H - 2B单体）的淋巴细胞，但还没有进一步的小鼠品系到目前为止评价。此外，调整细胞密度的差异，细胞因子的浓度，持续时间环孢素A治疗，细胞培养基和菜肴也可能导致CD40的小鼠的B细胞类似的增殖率，有效地激活。然而，密集的工作已经花费了优化这个系统，最大限度地激活和增殖率，在现行制度。
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Disclosures
实验是按照实验动物饲养的国家和欧洲的指引。在谈到德国的动物福利法，动物是由当局控制的定期的。
Acknowledgments
我们诚恳地感谢克莱门斯Wendtner博士提供tmuCD40配体HeLa细胞株。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| Hygromycin B, 0.2 mg/mL | |||
| 3. mCD40-B washing medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 4. mCD40-B culture medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| MEM, 0.1mM (1x) | |||
| FBS, 10% | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| RPMI 1640 | Invitrogen | REF 21875 | |
| D-MEM | Invitrogen | REF 41965 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| MEM NEAA | Invitrogen | REF 11140 | |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | Cat No P02-015 | |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
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