Summary
في هذا الفيديو ، ونحن لشرح اجراءات التنشيط CD40 ، والتوسع في خلايا الفئران B من splenocytes من C57BL / 6 الفئران ، والتي يمكن استخدامها بوصفها خلية مستضد تقديم نموذج (APC) لدراسة تحريض الحصانة.
Abstract
وقد أظهرت البحوث على الخلايا البائية أن التنشيط CD40 يحسن قدرتها على تقديم المستضد. عندما حفز مع وانترلوكين 4 - CD40 يجند (CD40L) ، يمكن توسيع خلايا B الإنسان دون صعوبات من كميات صغيرة من الدم المحيطي في غضون 14 يوما لكميات كبيرة جدا من خلايا CD40 - B نقية عالية (> 10
Protocol
ينقسم بروتوكول لجيل من الفئران خلايا B - CD40 تنشيط (mCD40B) من splenocytes إلى جزأين : الجزء ألف يوضح إعداد يجند CD40 الفئران (CD40L) معربا عن خلايا هيلا (tmuCD40L هيلا) ، والتي سوف تستخدم لوحة ، كما منضم الخلايا المغذية. الجزء باء يصف الفعلية الفئران CD40 - B الثقافة.
A. إعداد الخلايا المغذية (tmuCD40L هيلا)
وهيلا tmuCD40L هو ملتصق الإنسان خط الخلايا الظهارية ، والتي لا ينبغي أبدا أن تصبح متكدسة تماما. وبالتالي فإن الخلايا splitted مرتين في الأسبوع. لا ينصح زراعة على مدى أكثر من 6 أسابيع.
- إزالة المتوسطة القديمة من ثقافة الأولية مع ماصة معقمة وغسل الخلايا مع 10 مل من 1X PBS. نضح في برنامج تلفزيوني بعد الغسيل.
- إضافة 4 مل من التربسين 1X / EDTA في قارورة 75 2 سم لمدة 10-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. استخدام التنصت لطيف لفصل الخلايا.
- إضافة 10 مل من النوع المتوسط البرية ودوار لوقف بلطف مع الهضم التربسين.
- نقل تعليق الخلية في أنبوب 50 مل مع ماصة معقمة وتدور الخلايا في أسفل 265 x ج لمدة 7 دقائق.
- إزالة وطاف resuspend الكرية خلية في المتوسط 10 مل من نوع البرية. حساب عدد الخلايا من قسامة لتعليق الخلية وإعداد ثلاث أنابيب 50 مل مع عدد مناسب من الخلايا :
- 2.5 × 10 6 خلايا لثقافة فرعية
- 0.4 × 10 6 خلية / جيد لاستخدام أشعة لثقافة الفئران خلايا CD40 - B
- تبقى لتجميد (عند الحاجة).
- تدور الخلايا في أسفل 265 x ج لمدة 7 دقائق.
- إزالة طاف.
- لsubculturing : resuspend 2.5 × 10 6 خلايا في المتوسط 10 مل التحديد في 75 سم 2 خلية قارورة الثقافة (2.5 × كثافة الخلية 10 5 خلية / مل) ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2. انقسام الخلايا مرتين في الأسبوع.
- للثقافة الفئران الخلايا CD40 - B : تحتاج 2.4 × 10 6 خلايا لوحة 6 - جيدا واحدة. Resuspend في tmuCD40L خلايا هيلا في المتوسط النوع البري في مناطق ذات كثافة تبلغ 0.2 X 6 10 الخلايا / مل ، وأشرق لهم في 78 غراي. لوحة 2 مل من تعليق خلية في كل بئر واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2. استخدام هذه اللوحات المعدة لتنشيط خلايا B عندما tmuCD40L خلايا هيلا هي ملتصقة (على الأقل 4 ساعات : التحقق من الالتزام باستخدام المجهر ، لا تنتظر أكثر من 24 ساعة لبدء الخلية B - التحفيز). (متابعة باء)
باء الفئران CD40 - B خلية ثقافة
أولا إعداد splenocytes لتحفيز - CD40 (يوم 0) :
يرجى ملاحظة : قبل متابعة التأكد من أن الخلايا المغذية هي ملتصقة. دائما إضافة حلول جديدة من الفئران على الفور انترلوكين 4 ، β المركابتويثانول والسيكلوسبورين ألف للمتوسط النمو قبل الاستخدام.
- تشريح الطحال لتستكمل C57BL / 6 الفئران (النمط الفرداني H - 2B) وغسله مرتين في DMEM 10-20 مل مع الجنتاميسين [15μg/mL] من قبل نقله مع طرف ماصة 10ML من أنبوب واحد إلى آخر. تجنب نقل الملوثات (مثل الشعر) من الفأرة. فرم الطحال بتمريرها من خلال مصفاة الخلية (100μm) وشطف مصفاة أخرى مع 10 مل من المتوسط. تدور في أسفل splenocytes 265 x ج لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ولهم في resuspend 7mL muCD40 - B المتوسطة الخلية ، والخلايا الليمفاوية منفصلة بواسطة الطرد المركزي Ficoll الكثافة. للقيام بذلك طبقة الخلايا في 5 مل الماوس Pancoll (مسخن في درجة حرارة الغرفة) في أنبوب مل 15 و 450 جهاز طرد مركزي في XG لمدة 30 دقيقة بدون فرامل في درجة حرارة الغرفة.
- رسم قبالة معظم الطبقة العليا ، وترك طبقة دون عائق لمفاوية في الواجهة. نقل طبقة الخلايا اللمفاوية لأنبوب جديد 50 مل ، ويغسل مرة واحدة مع DMEM 30mL مع الجنتاميسين [15μg/mL] من الغزل إلى أسفل في 265 x ج لمدة 7 دقائق لإزالة الخلايا الأخرى. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 10 مل من mCD40 - B المتوسطة الغسيل. تحديد عدد الخلايا في قسامة لتعليق الخلية. تحديد عدد الخلايا التي قسامة دون حساب لتعليق الخلية.
- تدور باستمرار على المبلغ المطلوب من الخلايا في 265 x ج لمدة 7 دقائق. لوحة 6 - جيدا 5 × 10 6 خلية / كذلك هناك حاجة ، وبالتالي 30 × 10 6 خلية لكل لوحة.
- طاف وإزالة الخلايا الليمفاوية في resuspend 1.25 × 6 10 خلايا / مل في mCD40 - B مستنبت استكملت حديثا مع 1 يو / مل من 4 انترلوكين مثل عامل النمو ، و 100 ميكرومتر β - المركابتويثانول و 0.63 ميكروغرام / مل السيكلوسبورين A لمنع ثمرة من خلايا تي (تركيزات نظرا تشير إلى واحد مل مستنبت!).
- إزالة طاف من لوحة 6 - جيدا قبل المحتضنة مع خلايا هيلا tmuCD40L.
- إضافة بلطف 4 مل من تعليق لمفاوية (1.25 × 10 6 خلية / مل) على كل جانب من لوحة 6 - جيدا.
- احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2. في يوم 3 reculture الخلايا (متابعة II.1).
II. ثقافة فرعية من الخلايا mCD40B (يوم 3 ثم مرتين في الأسبوع) :
- حصاد الخلايا العنقودية التي mCD40B pipetting بقوة صعودا ونزولا مع ماصة 10 مل وتجمع لهم في أنبوب 50 مل.
- تدور في اسفل 265 x ج لمدة 7 دقائق واستبدالها تماما طاف مع mCD40 - B المتوسطة الغسيل. في حين عد كمية من الخلايا قسامة ، وتدور الخلايا في أسفل 265 x ج لمدة 7 دقائق. Resuspend الخلايا mCD40B في mCD40 - B مستنبت بتركيز 0.75 X الخلايا 6 10 / مل.
- إضافة حلول جديدة من الفئران انترلوكين 4 في تركيز 1 U / مل و 100 ميكرومتر المركابتويثانول - β و 0.63 ميكروغرام / مل السيكلوسبورين ألف للمتوسط.
- إزالة طاف من لوحة 6 - جيدا قبل المحتضنة مع خلايا هيلا tmuCD40L المشع.
- إضافة بلطف 4 مل من تعليق خلية mCD40B (0.75 × 10 6 خلية / مل) على كل جانب من لوحة 6 - جيدا.
- احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2.
- مرة أخرى فرعية الخلايا كل 3-4 أيام في نهاية المطاف مع نقية للغاية الفئران خلايا B - CD40 تفعيلها بعد ما مجموعه 14 يوما.
جيم حل المشاكل : ماذا لو CD40 - B الخلايا لا تنمو؟
- هل راجعت للتعبير يجند CD40 الخلايا المغذية؟
- هي الخلايا المغذية لوحة محددة تستخدم لتحفيز كبار السن من 24H؟
- هل هناك تلوث مع الميكوبلازما؟
- كان الحل انترلوكين - 4 المستخدمة لإذابة مكملات طازجة وأنه لم يكون النشاط المناسب البيولوجي؟
- وكان β - المركابتويثانول السيكلوسبورين وإضافة في التركيز الصحيح؟
الشكل 1A.
الشكل 1B.
الرقم 1D.
الشكل 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إدخال تعديلات على هذا البروتوكول أمر ممكن ، وخصوصا فيما يتعلق أصل التحفيز CD40 ونوع السلالة الماوس المستخدمة ، مما أسفر أيضا في توليد خلايا الفئران كفاءة B - CD40 تفعيلها. الأحمدي وآخرون. وقد أظهرت نتائج مماثلة بالنسبة لالليفية الماوس transfected مع الفئران CD40 - يجند. ويمكن في هذا العرض سياق xeno مستضد استبعادها على وجه اليقين ، إلا أن الدراسات المكثفة حول الأمن والسمية في الجسم الحي لم يعط إشارات رد فعل تلقائي أو التهاب الحصانة في هذا الإعداد باستخدام الخلايا البشرية transfected هيلا. ومع ذلك ، فإن أفضل بديل يمثل الفئران ذوبان CD40 - يجند مع تفعيل وانتشار النشاط في نفس الوقت ، وهو على حد علمنا لم تكن متاحة تجاريا.
هذا البروتوكول يعمل أيضا على الخلايا الليمفاوية من الفئران 129S2/SvPas (النمط الفرداني H - 2B) ، ولكن لم يتم تقييمها من أجل مزيد من سلالات الفأر حتى الآن. وعلاوة على ذلك الاختلافات في تعديل كثافة الخلية ، وتركيز خلوى ، ومدة العلاج والسيكلوسبورين ، قد وسائل الإعلام والثقافة الخلية الأطباق يؤدي أيضا إلى تفعيل كفاءة الخلايا CD40 - B الفئران ذات معدلات الانتشار مماثلة. ومع ذلك ، فقد أنفق العمل المكثف على تحسين هذا النظام وتعظيم معدلات انتشار التنشيط الناتجة في النظام الحالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وأجريت التجارب وفقا لمبادئ توجيهية وطنية وأوروبية لحفظ الحيوانات المختبرية. وكانت تسيطر عليها إحالة قانون الرفق بالحيوان الالمانية الحيوانات بشكل منتظم من قبل السلطات المختصة.
Acknowledgments
نشكر الدكتور كليمنس تتكرم Wendtner لتوفير tmuCD40 - يجند الحله خط الخلية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| Hygromycin B, 0.2 mg/mL | |||
| 3. mCD40-B washing medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 4. mCD40-B culture medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| MEM, 0.1mM (1x) | |||
| FBS, 10% | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| RPMI 1640 | Invitrogen | REF 21875 | |
| D-MEM | Invitrogen | REF 41965 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| MEM NEAA | Invitrogen | REF 11140 | |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | Cat No P02-015 | |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
- Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
- Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
- von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
- Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
- Bergwelt-Baildon, M. S. von Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
- Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).
