Summary
In questo video, dimostriamo la procedura di CD40-attivazione e l'espansione delle cellule B da splenociti murini di C57BL / 6 topi, che può essere utilizzato come modello di una cellula presentanti l'antigene (APC) per studiare l'induzione di immunità.
Abstract
La ricerca sulle cellule B CD40 ha dimostrato che l'attivazione di migliorare la loro capacità di presentazione dell'antigene. Se stimolati con interleuchina-4 e CD40 ligando (CD40L), le cellule B umane può essere ampliato senza difficoltà da piccole quantità di sangue periferico entro 14 giorni di tempo per grandi quantità di altamente puri-CD40 delle cellule B (> 10
Protocol
Il protocollo per la generazione di murino CD40 delle cellule B attivate (mCD40B) da splenociti è diviso in due parti: la parte A dimostra la preparazione di murino CD40 ligando (CD40L) che esprime cellule HeLa (tmuCD40L HeLa), che sarà usato come piastra legato cellule nutrici. Parte B descrive l'attuale murino B CD40-cultura.
A. Preparazione di cellule di alimentazione (tmuCD40L HeLa)
Il HeLa tmuCD40L è un aderente linea di cellule epiteliali umane, che non dovrebbe mai diventare completamente confluenti. Le cellule sono quindi suddivisi due volte alla settimana. Coltura per più di 6 settimane non è raccomandato.
- Rimuovere medio vecchio dalla coltura primaria con una pipetta sterile e lavare le cellule con 10 ml di PBS 1x. Aspirare il PBS dopo il lavaggio.
- Aggiungere 4 ml di 1x tripsina / EDTA in 75 2 centimetri a riposo per 10-15 minuti a 37 ° C. Usa picchiettando leggermente per staccare le cellule.
- Aggiungere 10 ml di medium di tipo selvatico e girevole delicatamente per fermare la digestione con tripsina.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 ml con una pipetta sterile e girare le celle in basso a 265 xg per 7 minuti.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di medium di tipo selvatico. Contare il numero di cellulare di una aliquota della sospensione cellulare e preparare tre da 50 mL con il numero appropriato di cellule:
- 2,5 x 10 6 cellule per la subcultura
- 0,4 x 10 6 cellule / pozzetto di irradiazione utilizzate nel murino CD40-B colture cellulari
- resto di congelare (se necessario).
- Spin le cellule verso il basso a 265 xg per 7 minuti.
- Rimuovere il surnatante.
- Per subcolture: risospendere 2,5 x 10 6 cellule in 10 ml di medie selezione in un centimetro 75 2 pallone di coltura cellulare (cellule densità di 2,5 x 10 5 cellule / ml) e incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2. Dividere le celle due volte alla settimana.
- Per la murino CD40-B coltura cellulare: Avete bisogno di 2,4 x 10 6 cellule per un 6-pozzetti. Risospendere le cellule tmuCD40L HeLa wild-type in media ad una densità di 0,2 x 10 6 cellule / ml e irradiare li a 78 Gy. Tavola 2 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto e incubare loro a 37 ° C con 5% di CO 2. Utilizzare questa piastre preparate per la stimolazione delle cellule B quando tmuCD40L cellule HeLa sono aderenti (almeno 4 ore: controllare l'aderenza con il microscopio, non aspettare più di 24 ore per iniziare la stimolazione delle cellule B). (Continua con B.)
B. murini CD40-B colture cellulari
I. Preparazione di splenociti per CD40-stimolazione (giorno 0):
Attenzione: prima di continuare a constatare che le cellule feeder siano aderenti. Aggiungere sempre soluzioni fresche di murini immediatamente interleuchina-4, β-mercaptoetanolo e ciclosporina A per il mezzo di crescita prima dell'uso.
- Sezionare milza di C57BL / 6 topi (aplotipo H-2b) e lavarlo due volte in 10-20 ml DMEM integrato con Gentamicina [15μg/mL] trasferendo con una punta da 10 ml pipetta da un tubo ad un altro. Evitare il trasferimento di contaminanti (ad esempio capelli) del mouse. Tritare milza passando attraverso un colino cella (100μm) e risciacquare con un altro filtro ml 10 di media. Spin down splenociti a 265 xg per 7 minuti a temperatura ambiente, li risospendere in 7 ml muCD40 media delle cellule-B e linfociti separati per centrifugazione densità Ficoll. Per fare questo strato di cellule, il 5 ml Mouse-Pancoll (preriscaldato a temperatura ambiente) in una provetta da 15 ml e centrifugare a 450 xg per 30 min, senza freno a temperatura ambiente.
- Erogare la maggior parte dello strato superiore, lasciando il livello dei linfociti indisturbato a livello di interfaccia. Trasferimento strato linfociti ad un nuovo tubo da 50 ml, lavare una volta con DMEM 30mL con Gentamicina [15μg/mL] riducendo la velocità a 265 xg per 7 minuti per eliminare altre cellule. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 10 ml di mCD40-B medio di lavaggio. Determinare il numero di cellule in una parte aliquota della sospensione cellulare. Determinare il numero delle cellule contando una aliquota della sospensione cellulare.
- Spin down la quantità necessaria di cellule a 265 xg per 7 minuti. Per un 6-pozzetti 5 x 10 6 cellule / pozzetto sono necessari, quindi 30 x 10 6 cellule per piastra.
- Rimuovere il surnatante e risospendere i linfociti a 1,25 x 10 6 cellule / ml in mCD40-B terreno di coltura fresco integrato con 1 U / mL di interleuchina-4 come fattore di crescita, 100 mM β-mercaptoetanolo e 0,63 mg / ml ciclosporina A per prevenire conseguenza di cellule T (concentrazioni indicati si riferiscono a un mezzo ml cultura!).
- Eliminare il surnatante dal 6 pozzetti pre-incubate con tmuCD40L cellule HeLa.
- Delicatamente aggiungere 4 ml di sospensione linfocitaria (1,25 x 10 6 cellule / ml) in ciascun pozzetto della piastra ben 6.
- Incubare la piastra a 37 ° C con 5% di CO 2. Il giorno 3 reculture le cellule (Continua con II.1.).
II. Sottocultura di cellule mCD40B (giorno 3 e poi due volte a settimana):
- Grappolo di cellule raccolta mCD40B da vigorosamente pipettando su e giù con una pipetta da 10 mL e la piscina in un tubo da 50 ml.
- Spin down a 265 xg per 7 minuti e sostituire completamente il sopranatante con mCD40-B medio di lavaggio. Mentre conta la quantità delle cellule di una aliquota, girare la celle in basso a 265 xg per 7 minuti. Risospendere le cellule in mCD40B mCD40-B terreno di coltura ad una concentrazione di 0,75 x 10 6 cellule / ml.
- Aggiungi soluzioni fresche di murini interleuchina-4 in una concentrazione di 1 U / mL, 100 mM β-mercaptoetanolo e 0,63 mg / ml ciclosporina A per la media.
- Rimuovere il surnatante da un 6-pozzetti pre-incubate con irradiati tmuCD40L cellule HeLa.
- Delicatamente aggiungere 4 ml di sospensione cellulare mCD40B (0,75 x 10 6 cellule / ml) in ciascun pozzetto della piastra ben 6.
- Incubare le piastre a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Anche in questo caso le cellule sottocultura ogni 3-4 giorni per finire con elevata purezza murino CD40 delle cellule B attivate dopo un totale di 14 giorni.
C. Soluzione dei problemi: cosa succede se le cellule B CD40-non crescono?
- Hai controllato di espressione ligando CD40 delle cellule alimentatore?
- Sono legato piastra cellule alimentatore utilizzato per la stimolazione più di 24 ore?
- C'è una contaminazione con micoplasma?
- È stata la interleuchina-4 soluzione utilizzata per la supplementazione appena scongelati e ce l'ha l'attività biologica appropriata?
- Era β-mercaptoetanolo e ciclosporina A aggiunti nella concentrazione giusta?
Figura 1a.
Figura 1b.
Figura 1d.
Figura 2.
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Discussion
Le modifiche di questo protocollo sono possibili, soprattutto per quanto riguarda l'origine di CD40-stimolo e il tipo di ceppo di topi utilizzati, anche cedendo nella generazione efficiente di murini CD40 delle cellule B attivate. Ahmadi et al. hanno mostrato risultati simili per i fibroblasti di topo murine transfettate con CD40-ligando. In questa presentazione contesto di xeno-antigene può essere esclusa con certezza, ma studi approfonditi in materia di sicurezza e tossicità in vivo non ha dato segni di reazione infiammazione o di auto-immunità in questa impostazione utilizzando cellule umane HeLa transfettate. Tuttavia, la migliore alternativa rappresenta una murino-ligando CD40 solubile con l'attivazione e la proliferazione di attività, allo stesso tempo, che è a nostra conoscenza non disponibili in commercio.
Questo protocollo funziona anche per i linfociti dai mouse 129S2/SvPas (aplotipo H-2b), ma non è stato valutato per altri ceppi di topi finora. Inoltre le differenze di regolazione della densità delle cellule, la concentrazione delle citochine, la durata del trattamento ciclosporina A, terreni di coltura cellulare e piatti può anche portare ad efficienza CD40-attivazione delle cellule B murino con tassi di proliferazione simili. Tuttavia, un intenso lavoro è stato speso per l'ottimizzazione di questo sistema massimizzando l'attivazione e tariffe conseguente proliferazione nel sistema attuale.
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Disclosures
Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida nazionali ed europee per il mantenimento degli animali da laboratorio. Riferendosi alla legge tedesca sul benessere degli animali gli animali erano controllati regolarmente dalle autorità competenti.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. Clemens Wendtner per fornire tmuCD40-Ligand-HeLa linea cellulare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| Hygromycin B, 0.2 mg/mL | |||
| 3. mCD40-B washing medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 4. mCD40-B culture medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| MEM, 0.1mM (1x) | |||
| FBS, 10% | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| RPMI 1640 | Invitrogen | REF 21875 | |
| D-MEM | Invitrogen | REF 41965 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| MEM NEAA | Invitrogen | REF 11140 | |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | Cat No P02-015 | |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
- Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
- Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
- von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
- Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
- Bergwelt-Baildon, M. S. von Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
- Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).
