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Immunology and Infection

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

doi: 10.3791/1734 Published: March 5, 2010

Summary

이 비디오에서는, 우리는 CD40 - 활성화 및 면역의 유도를 연구하는 모델 항원 제시 세포 (APC)로 사용할 수 있습니다 C57BL / 6 마​​우스 splenocytes에서 murine B 세포의 확장 프로 시저를 보여줍니다.

Abstract

B 세포에 관한 연구는 CD40 활성화들은 항원 프레 젠 테이션 능력을 향상하는 것으로 나타났습니다. 인터루킨 - 4 및 CD40 리간드 (CD40L)와 자극을 때, 인간의 B 세포는 고도로 순수 CD40 - B 세포 (매우 큰 금액을 14 일 이내에 말초혈 소량의 어려움없이 확장 가능> 10

Protocol

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splenocytes에서 murine CD40 - 활성화된 B 세포 (mCD40B)의 생성을 위해 프로토콜은 두 부분으로 나누어져있다 : 부품으로 사용됩니다 판 - 헬라 세포 (tmuCD40L 헬라)를 표현 murine CD40 리간드 (CD40L)의 준비를 보여줍니다 피더 세포를 바운드. 파트 B는 실제 murine CD40 - B 문화를 설명합니다.

피더 세포의 A. 준비 (tmuCD40L 헬라)

tmuCD40L 헬라 완전히 합류가해서는 안 자기편 인간 상피 세포주이다. 세포 따라서 주당 두번 splitted 수 있습니다. 6 개 이상 주 동안 Culturing하지 않는 것이 좋습니다.

  1. 멸균 피펫으로 기본 문화 올드 미디어를 제거하고 1X PBS의 10 ML과 세포를 씻으십시오. 세척 후 PBS를 대기음.
  2. 37 10-15분에 75cm 2 플라스크에 1X 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4 ML 추가 ° C. 세포를 분리하기 위해 부드러운 도청을 사용합니다.
  3. 야생 유형 매체 10 ML을 추가하고 트립신과 소화를 중지 부드럽게 회전.
  4. 멸균 피펫과 50 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송 7 분 동안 265 XG에서 세포를 스핀 다운.
  5. 뜨는을 제거하고 야생 유형 매체 10 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend. 세포 현탁액의 나누어지는의 휴대폰 번호를 카운트하고 세포의 적절한 수의 세 50 ML 튜브를 준비 :
    1. subculture 2.5 X 10 6 세포
    2. murine CD40 - B 세포 배양에 사용 / 잘 조사를위한 0.4 X 10 6 세포
    3. 프리즈에 나머지 (필요한 경우).
  6. 7분에 대한 265 XG에서 세포를 스핀 다운.
  7. 뜨는을 제거합니다.
    1. subculturing 들면 : resuspend 2.5 75cm 2 세포 배양 플라스크 10 ML 선택 매체 (세포 밀도 2.5 X 10 5 셀 / ML) 37에서 세포를 품어 X 10 6 세포 ° C와 5 % CO 2. 두 당 주 세포를 분리.
    2. murine CD40 - B 세포 배양의 경우 : 한 6 자 접시 2.4 X 10 6 세포가 필요합니다. 0.2 X 10 6 세포 / ML의 밀도에 야생 유형의 매체에 tmuCD40L 헬라 세포를 Resuspend하고 78 쥐에서 그들을 비추다. 물론 각 37에서 그들을 품어 ° C와 5 % CO 2에 세포 현탁액의 플레이트 2 ML. tmuCD40L 헬라 세포가 자기편 때 B - 세포 자극이 준비한 접시를 사용합니다 (최소한 4 시간 : 현미경을 사용하여 준수를 확인, B - 세포 자극을 시작하는 이상 24 H를 기다리지 않는다). (B. 계속)

B. Murine CD40 - B 세포 배양

CD40 - 자극 (일 공)에 대한 splenocytes의 I. 준비 :

주의 : 당신이 피더 세포가 자기편 것을 확인할 계속하기 전에. 항상 murine 인터루킨 - 4, β - 메르 캅 토 에탄올과 성장 매체 시클 로스 포린 바로 사용하기 전에 새로운 솔루션을 추가합니다.

  1. C57BL / 6 마​​우스 (haplotype H - 2B)의 비장을 절개하다하고 10-20 ML DMEM에 두번 씻어 다른 한 튜브에서 10mL 피펫 팁로 전송하여 Gentamycin [15μg/mL]로 보충. 마우스의 전송 오염 물질 (예 : 머리카락)하지 마십시오. 셀 스트레이너 (100μm)를 통해 전달하여 비장을 말하다 및 매체의 또 다른 10 ML와 스트레이너를 헹굴. 상온에서 7 분 265 XG에 splenocytes를 스핀 다운, 7mL muCD40 - B의 세포 매체 및 Ficoll 밀도 원심 분리하여 별도의 lymphocytes들을 resuspend. 그렇게 30 분 450 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기 5 ML 마우스 Pancoll (실온에서 preheated)에 레이어 셀을 상온에서 브레이크없이 할 수 있습니다.
  2. 인터페이스에서 그대로 림프구 계층을 떠나, 상위 레이어의 대부분을 그립니다. 새로운 50 ML 튜브에 림프구 계층을 전송, 기타 세포를 제거 7 분 265 XG에 가서 회전에 의해 Gentamycin [15μg/mL]와 30mL DMEM과 함께 한 번 씻는다. 뜨는을 취소하고 mCD40 - B 세척 매체 10 ML에있는 세포를 resuspend. 세포 현탁액의 나누어지는의 휴대폰 번호를 확인합니다. 세포 현탁액의 나누어지는를 세어 휴대폰 번호를 확인합니다.
  3. 7분에 대한 265 XG에서 세포의 필요한 양을 스핀 다운. 6 잘 플레이트 5 X 10 6 세포 / 잘 따라서 판 30 X 10 6 셀 필요합니다.
  4. 뜨는를 제거하고 성장 요소로, 시클 로스 포린 100 μm의 β - 메르 캅 토 에탄올 및 0.63 μg / ML은 방지하기 위해 갓 1 U / 인터루킨 - 4의 ML과 보충 mCD40 - B 문화 매체 1.25 X 10 6 세포 / ML에서 lymphocytes을 resuspend T - 세포의 가지 (감안할 때 농도가 한 ML 문화 매체를 참조!).
  5. 6 잘 플레이트 tmuCD40L 헬라 세포로 사전 incubated에서 뜨는을 제거합니다.
  6. 부드럽게 6 잘 접시의 각각 잘 수있는 림프구 정지 4 ML (1.25 X 10 6 세포 / ML)를 추가합니다.
  7. 37 접시를 품어 ° C 5 % CO 2. 일 3 전지 (II.1 계속.) reculture.

II. mCD40B 세포 (3 일 후 일주일에 두 번)의 Subculture :

  1. 노골적인 협상을 50 ML 튜브에 10 ML의 피펫과 수영장 그들과 함께 위아래로 pipetting하여 수확 mCD40B 전지 클러스터.
  2. 7분에 대한 265 XG에 스핀 다운 및 완전히 mCD40 - B 세척 매체로 뜨는 교체하십시오. 나누어지는의 세포 금액을 계산하는 동안, 7 분 동안 265 XG에서 세포를 스핀 다운. 0.75 X 10 6 세포 / ML의 농도에서 mCD40 - B 문화 매체 Resuspend mCD40B 세포.
  3. 1 U / ML, 100 μm의 β - 메르 캅 토 에탄올의와 매체 시클 로스 포린 0.63 μg / ML의 농도에서 인터루킨 - 4 murine의 새로운 솔루션을 추가합니다.
  4. 6 잘 플레이트 조사 tmuCD40L 헬라 세포로 사전 incubated에서 뜨는을 제거합니다.
  5. 부드럽게 6 잘 접시의 각각 잘 수있는 mCD40B 세포 현탁액 (0.75 X 10 6 세포 / ML) 4 ML를 추가합니다.
  6. 37 접시를 품어 ° C 5 % CO 2.
  7. 다시 모든 3~4일 14 일 총 후에 매우 순수 murine CD40 - B 세포 활성화와 최종 수있는 세포가 subculture.

C.의 문제 해결 : 어떤 경우 CD40 - B 세포 성장하지?

  1. 당신은 피더 세포의 CD40 리간드 발현에 대한 검사 있습니까?
  2. 24 세 이상 자극에 사용되는 플레이트 - 바운드 피더 세포 있습니까?
  3. mycoplasma와 오염이 있나요?
  4. 보완을 위해 사용되는 인터루킨 - 4 솔루션은 신선한 해동이고 이것은 적절한 생물 학적 활동을 있었나요?
  5. β - 메르 캅 토 에탄올과 시클 로스 포린 A는 정확한 농도에 추가습니까?

그림 1
그림 1A.

그림 1 B
그림 1B.

그림 1 D
그림 1D.

그림 2
그림 2.

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Discussion

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이 프로토콜의 수정은 특히도 murine CD40가 활성화된 B 세포의 효율적인 세대에 항복, CD40 - 자극 및 사용 마우스 변형의 유형의 기원에 대해 가능합니다. 아마디 외. CD40 - 리간드와 transfected murine 마우스 섬유아 세포에 대한 유사한 결과를 보여주었다. 외부의 항원이 맞는 프레 젠 테이션에서 확실하게 제외하지만, 보안 및 생체내의 독성에 관한 집중 연구는 인간의 transfected 헬라 세포를 사용하여이 설정에 염증이나 면역 반응 자동에 대한 표지판을 준 수 없습니다. 그러나, 가장 좋은 대안은 우리의 지식을 상업적으로 사용할 수 없습니다 동시에 활동을 활성화하고 proliferating과 CD40 - 리간드 가용성 murine을 나타냅니다.

이 프로토콜은 또한 129S2/SvPas 마우스 (haplotype H - 2B)에서 lymphocytes에 대한 작동하지만, 지금까지 추가로 마우스 종자에 대한 평가되지 않았습니다. 또한 세포 밀도 조정의 차이, 시토킨 농도, 시클 로스 포린의 기간은 치료, 세포 배양 매체와 요리도 유사한 확산 속도로 murine B 세포의 효율적인 CD40 - 활성화로 이어질 수 있습니다. 그러나, 집중적인 작업이 활성화되고 현재의 시스템에서 발생하는 확산 속도를 최대화이 시스템을 최적화하는 지출되었습니다.

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Disclosures

실험은 실험실 동물 관리 방법에 대한 국내 및 유럽 지침에 따라 수행되었다. 독일의 동물 복지 법률을 참조하면 동물이 적절한 당국에 의해 정기적으로 제어되었다.

Acknowledgments

우리는 친절 tmuCD40 - 리간드 - 헬라 세포 라인을 제공 클레멘스 박사 Wendtner 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
RPMI 1640
L-Glutamine, 300 μg/mL
FBS, 10%
HEPES, 10 mM
Gentamycin, 15 μg/mL
2. Feeder cell selection medium
RPMI 1640
L-Glutamine, 300 μg/mL
FBS, 10%
HEPES, 10 mM
Gentamycin, 15 μg/mL
Hygromycin B, 0.2 mg/mL
3. mCD40-B washing medium
D-MEM
L-Glutamine, 580 μg/mL
Glucose, 4.5 mg/mL
HEPES, 10 mM
Gentamycin, 15 μg/mL
4. mCD40-B culture medium
D-MEM
L-Glutamine, 580 μg/mL
Glucose, 4.5 mg/mL
HEPES, 10 mM
Gentamycin, 15 μg/mL
MEM, 0.1mM (1x)
FBS, 10%
B. Miscellaneous Reagents:
RPMI 1640 Invitrogen REF 21875
D-MEM Invitrogen REF 41965
Dulbecco’s PBS (10x) PAA Laboratories Cat No H15-011
Gencin® Delta Select Art No 7395800
FBS Lonza Inc. Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Laboratories Cat No S11-001
MEM NEAA Invitrogen REF 11140
Hygromycin B PAA Laboratories Cat No P02-015
Recombinant Murine Interleukin-4 Immunotools Cat No 12340045
Cyclosporin A Novartis AG Cat No NDC 0078-0109-01
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:
Sterile pipette tips Sarstedt Ltd
6-well plate Nalge Nunc international Cat No 140675
50mL conical tube BD Biosciences Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Ltd Cat No 83.1813.002

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References

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Liebig, T. M., Fiedler, A., Klein-Gonzalez, N., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. Murine Model of CD40-activation of B cells. J. Vis. Exp. (37), e1734, doi:10.3791/1734 (2010).More

Liebig, T. M., Fiedler, A., Klein-Gonzalez, N., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. Murine Model of CD40-activation of B cells. J. Vis. Exp. (37), e1734, doi:10.3791/1734 (2010).

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